Voges-Proskauerin testausperusta, valmistelu ja käyttö



Voges-Proskauer-testi on biokemiallinen testi, jota käytetään tunnistamaan Enterobacteriaceae-sukuun kuuluvat bakteerit. Erityisesti on hyödyllistä erottaa Escherichia coli of Klebsiella ja Enterobacter, muun muassa.

Testi suoritetaan nestemäisessä viljelyalustassa, jota kutsutaan metyyli- punaiseksi Voges Proskaueriksi, joka tunnetaan paremmin lyhenteellä RM / VP. Tämä väliaine koostuu puskuroidusta polypeptidista, glukoosista, dikaliumfosfaatista ja tislatusta vedestä.

Nykyinen RM / VP-väliaine on Clark- ja Lubs-alustan modifikaatio, joka sisälsi alun perin pienemmän pitoisuuden peptoneja ja glukoosia. Siksi tuotettiin vähemmän vetyionia, jota tarvitaan positiivisen Voges-Proskauer-reaktion aikaansaamiseksi.

Testi perustuu mikro-organismin kykyyn käyttää glukoosia butyleeniglykolireitin kautta ja muodostaa neutraalin lopputuotteen, jota kutsutaan asetoiiniksi hapen ja alkalisen pH: n läsnä ollessa..

RM / VP-väliaineessa voidaan lisäksi paljastaa Voges-Proskauer-testi, mutta myös metyylipunainen testi voidaan paljastaa.

indeksi

  • 1 Säätiö
    • 1.1 Voges-Proskauer-testin perusta
    • 1.2 Testin ja tulkinnan kehittämisen perusteet
  • 2 Valmistelu
    • 2.1 Medium RM / VP
    • 2.2 Voges A Reagenssi
    • 2.3 Voges B -reagenssi
  • 3 Voges-Proskauer-testin menettely
    • 3.1 Testin kehittäminen
  • 4 Käytä
  • 5 Laadunvalvonta
  • 6 Viitteet

perusta

Voges-Proskauer-testin perusta

Väliaineessa olevat pluripeptonit tarjoavat ravitsemukselliset tarpeet, jotka ovat välttämättömiä bakteerien kasvulle. Glukoosi on puolestaan ​​tärkein yhdiste. Monilla bakteereilla on kyky metaboloida glukoosia ja muodostaa pyruvihappoa.

Pyruvihappo on glukoosin metabolian keskipiste ja sieltä kukin mikro-organismi voi kulkea eri tavoin. Jotkut muodostavat seka- happoja, kuten maitohappoa, etikkahappoa, muurahaishappoa ja meripihkahappoa, ja toiset muodostavat neutraaleja tuotteita, kuten 2,3-butaanidiolia.

Voges-Proskauer-testi paljastaa mikro-organismin kyvyn muodostaa asetyyli-metyylikarbinolia (asetoiinia), joka on 2,3-butaanidiolin välituote aerobisissa olosuhteissa.

Asetoiini pelkistyy ja muodostaa 2,3-butaanidiolia, mutta tämä reaktio on palautuva, joten jos 2,3-butaanidioli hapetetaan, muodostuu asetoiini. Siksi happi on välttämätöntä.

Dikaliumfosfaatti on puskuri, joka vaimentaa seosta pH: ssa 6,9 ± 0,2..

Testin ja tulkinnan kehittämisen perusteet

Reaktion osoittamiseksi on suoritettava kehitys käyttäen kahta reagenssia (Barrit-reagensseja), jotka tunnetaan nimellä Voges A ja Voges B.

Voges A on a-naftolin 5-prosenttinen liuos ja Voges B on 40-prosenttinen kaliumhydroksidivalmiste. Jos kaliumhydroksidia ei ole saatavilla, se voidaan korvata 40-prosenttisella natriumhydroksidilla.

Α-naftoli on katalyytti, joka lisää reaktion värin voimakkuutta, mikä tekee testistä herkempää. A-naftoli täytyy aina lisätä ensin, sekoittaen putkea niin, että väliaine joutuu kosketuksiin hapen kanssa. Tällä tavoin läsnä oleva asetoiini hapetetaan diasetyyliksi ja 2,3-butaanidioli hapetetaan muodostamaan asetoiinia, joka kuljettaa se diatsetyyliin.

Näin a-naftoli sitoutuu diasetyyliin, joka puolestaan ​​on liitetty aminohappo-arginiinissa olevaan guanidiini- tumaan, joka on peräisin pluripeptonista..

Kalium- tai natriumhydroksidi on omalta osaltaan vastuussa CO: n absorboimisesta2 ja reagoi peptonien kanssa. Tämä reaktio aiheuttaa vaaleanpunaisen-lohen värin muodostumisen, joka näkyy selvästi putken ravistamisen jälkeen hyvin.

Jotta väritys tapahtuisi välittömästi, oikeat määrät diasetyyliä, peptonia ja a-naftolia on sekoitettava. Jos näin ei tapahdu, anna putken levätä 15 minuuttia ennen tulkintaa.

Testi on yleensä positiivinen 2-5 minuutin kuluttua, kun vaaleanpunainen väri on havaittavissa. Jos se jää lepoon 30 minuutista 1 tuntiin, värin voimakkuus on suurin (syvä punainen).

Negatiivinen testi on ilmeinen, kun liemi on keltainen. 1 tunnin kuluttua, jos testi on negatiivinen, kuparin väri voidaan muodostaa kaliumhydroksidin a-naftoliinin reaktion seurauksena.

valmistelu

Medium RM / VP

Punnitaan 17 g kuivattua kasvualustaa ja liuotetaan yhteen litraan tislattua vettä. Anna seistä 5 minuuttia. Kuumenna kiehuvaksi, kunnes se liukenee kokonaan. Palvella 3 - 4 ml putkissa ja steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuuttia.

Dehydratoitu viljelyalusta on beige ja valmistettu väliaine on kevyt keltainen.

Väliaineen lopullinen pH on 6,9 ± 0,2.

Voges A -reagenssi

Punnitaan 5 g a-naftolia ja liuotetaan 50 ml: aan etyylialkoholia (absoluuttinen). Sen jälkeen lisätään etyylialkoholia lisäämällä 100 ml: aan.

Reagenssi Voges B

Punnitaan 40 g kaliumhydroksidia ja liuotetaan 50 ml: aan tislattua vettä dekantterilasissa. Lasi tulee sijoittaa kylmään vesihauteeseen lämpötilan säätämiseksi, koska valmisteen liukenemisen aikana se nousee voimakkaasti.

Sen jälkeen kun liuos on kylmä, se siirretään asteittaiseen ilmapalloon ja saatetaan 100 ml: aan tislatulla vedellä.

Voges-Proskauer-testin menettely

Voges-Proskauer-testin suorittamiseksi RM / VP-liemi siirrostetaan tutkittavalla mikro-organismilla puhtaasta 18 - 24 tunnin viljelmästä..

Inokulaatti ei saisi olla liian tiheä. Sitä inkuboidaan 35-37 ° C: ssa 24 - 48 tuntia, vaikka joskus inkubointi on välttämätöntä useita päiviä. Cowan ja Steel uskovat, että 5 päivää on minimipitoisuus, joka tarvitaan kaikkien positiivisten Voges-Proskauer (VP) -lajien tunnistamiseen Enterobacteriaceae-sukuista.

Testin kehittäminen

Erota 1 ml: n alikvootti putkeen ja suorita kehitys seuraavasti: laita 12 tippaa (0.6 ml) Voges A -reagenssia ja 4 tippaa (0,2 ml) Voges B. Mixiä ilmastaaksesi ja anna seistä seistä 5 - 10 minuuttia ennen suoritusta. Jos testi on kuitenkin edelleen negatiivinen, anna sen seistä ja tarkkailla putkea 30 minuutin - 1 tunnin kuluttua.

Vaaleanpunaisen punaisen värin ulkonäkö osoittaa, että Voges-Proskauer-reaktio on positiivinen. Jos väliaine pysyy keltaisena, reaktio on negatiivinen.

Kehittäjien lisääminen ilmoitetussa järjestyksessä ja määrässä on välttämätöntä väärien negatiivien välttämiseksi.

käyttö

Voges-Proskauer-testi on käyttökelpoinen erottamaan E. coli jotka ovat negatiivisia, muun muassa Klebsiella, Enterobacter, Serratia, jotka ovat VP: n myönteisiä.

Laadunvalvonta

Kontrollikantoja voidaan käyttää valmistetun väliaineen laadun testaamiseen. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium ja Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Odotetut tulokset ovat positiivisia Voges-Proskauer-reaktioita vain K. pneumoniae ja E. cloacae. Loput antavat negatiivisia reaktioita.

viittaukset

  1. Laboratories Britania. MR-VP Medium. 2015. Saatavilla osoitteessa: www.britanialab.com
  2. Microkit Laboratories M-Ident Voges Proskauer. 2014. Saatavilla: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti merkittävien bakteerien tunnistamiseksi. 3. ed. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires Argentiina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scottin mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana S.A. Argentiina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5th ed. Toimituksellinen Panamericana S.A. Argentiina.