Endonukleaasien toiminnot ja tyypit



endonukleaaseista ovat entsyymit, jotka leikkaavat nukleotidiketjun sisällä olevat fosfodiesterisidokset. Endonukleaasien restriktiokohdat ovat hyvin vaihtelevia. Jotkut näistä entsyymeistä leikkaavat DNA: ta (deoksiribonukleiinihappoa, geneettistä materiaalia) melkein missä tahansa, eli ne ovat epäspesifisiä.

Sitä vastoin on olemassa toinen endonukleaasiryhmä, jotka ovat hyvin spesifisiä alueella tai sekvenssissä, jota ne valmistavat. Tämä entsyymiryhmä tunnetaan restriktioentsyymeinä, ja ne ovat hyvin käyttökelpoisia molekyylibiologiassa. Tässä ryhmässä on tunnettuja entsyymejä BamHI, Eco RI ja Alu I.

Toisin kuin endonukleaaseilla, on toinen tyyppi katalyyttisiä proteiineja - eksonukleaaseja - jotka ovat vastuussa fosfodiesterilinkin katkaisemisesta ketjun lopussa.

indeksi

  • 1 Restriktion endonukleaasit
  • 2 Restriktioendonuksien toiminnot ja sovellukset
    • 2.1 Restriktiofragmentin pituuden polymorfismi (RFLP)
  • 3 Restriktioendonukleaasien tyypit
    • 3.1 Tyyppi I
    • 3.2 Tyyppi II
    • 3.3 Tyyppi III
    • 3.4 Tyyppi IV
  • 4 Viitteet

Restriktion endonukleaasit

Restriktioendonukleaasit tai restriktioentsyymit ovat katalyyttisiä proteiineja, jotka ovat vastuussa fosfodiesterisidosten lohkaisemisesta DNA-ketjun sisällä hyvin spesifisissä sekvensseissä.

Nämä entsyymit voidaan hankkia useissa bioteknologian yrityksissä ja niiden käyttö on lähes välttämätöntä nykyisten DNA-manipulaatiotekniikoiden sisällä.

Restriktioendonukleaasit nimetään käyttämällä sen organismin binomisen tieteellisen nimen ensimmäisiä kirjaimia, joista ne tulevat, ja sen jälkeen kantaa (tämä on valinnainen) ja päättyy ryhmään restriktioentsyymejä, joihin ne kuuluvat. Esimerkiksi BamHI ja EcoRI ovat laajalti käytettyjä endonukleaaseja.

DNA-aluetta, jonka entsyymi tunnistaa, kutsutaan restriktiokohdaksi ja se on ainutlaatuinen kullekin endonukleaasille, vaikka useat entsyymit voivat samaan aikaan restriktiokohdissa. Tämä kohta koostuu yleensä lyhyestä palindromisesta sekvenssistä, jonka pituus on noin 4 - 6 emäsparia, kuten AGCT (Alu I: lle) ja GAATTC EcoRI: lle..

Palindromiset sekvenssit ovat sekvenssejä, jotka, vaikka ne luetaan 5 '- 3' tai 3 '- 5' suuntaan, ovat identtisiä. Esimerkiksi EcoRI: n tapauksessa palindrominen sekvenssi on: GAATTC ja CTTAAG.

Restriktioendonuksien toiminnot ja sovellukset

Molekyylibiologien onneksi bakteerit ovat kehittyneet evoluution aikana joukon restriktioendonukleaaseja, jotka hajottavat sisäisesti geneettisen materiaalin.

Luonnossa nämä entsyymit ovat kehittyneet - oletettavasti - bakteerien suojausjärjestelmänä vieraiden DNA-molekyylien, kuten faagien, hyökkäyksen estämiseksi..

Oman ja vieraan geneettisen materiaalin erottamiseksi nämä restriktioendonukleaasit voivat tunnistaa spesifisiä nukleotidisekvenssejä. Siten DNA, jolla ei ole tätä sekvenssiä, voi häiritä bakteerin sisällä.

Sitä vastoin, kun endonukleaasi tunnistaa restriktiokohdan, se sitoutuu DNA: han ja leikkaa sen.

Biologit ovat kiinnostuneita tutkimaan elävien olentojen geneettistä materiaalia. DNA koostuu kuitenkin useista miljoonista peruspareista. Nämä molekyylit ovat erittäin pitkiä ja niitä tulisi analysoida pienissä fragmenteissa.

Tämän tavoitteen saavuttamiseksi restriktioendonukleaasit integroidaan erilaisiin molekyylibiologisiin protokolliin. Esimerkiksi yksittäinen geeni voidaan siepata ja kopioida tulevaa analyysiä varten. Tätä prosessia kutsutaan geenin "kloonaamiseksi".

Rajoitusfragmentin pituuden polymorfismi (RFLP)

Restriktiofragmentin pituuspolymorfismit viittaavat spesifisten nukleotidisekvenssien kuvioon DNA: ssa, jotka restriktioendonukleaasit kykenevät tunnistamaan ja leikkaamaan.

Entsyymien spesifisyyden ansiosta jokaiselle organismille on ominaista erityinen leikkauskuvio DNA: ssa, alkuperäinen fragmentti, jonka pituus on vaihteleva.

Restriktioendonukleaasien tyypit

Historiallisesti restriktioendonukleaasit on luokiteltu kolmeen tyyppiseen entsyymiin, jotka on merkitty roomalaisilla numeroilla. Viime aikoina on kuvattu neljäs tyyppi endonukleaasia.

Tyyppi I

Tyypin I endonukleaasien tärkein ominaisuus on se, että ne ovat useiden alayksiköiden muodostamia proteiineja. Kukin näistä toimii yhtenä proteiinikompleksina ja sillä on yleensä kaksi alayksikköä, joita kutsutaan nimellä R, kaksi M ja yksi S.

S-osa on vastuussa restriktiokohdan tunnistamisesta DNA: ssa. R-alayksikkö on toisaalta olennainen lohkaisun kannalta ja M vastaa metylaatioreaktion katalysoinnista.

Tyypin I entsyymejä on neljä alaryhmää, jotka tunnetaan kirjaimilla A, B, C ja D, jotka ovat yleisesti käytössä. Tämä luokitus perustuu geneettiseen komplementointiin.

Tyypin I entsyymit olivat ensimmäiset restriktioendonukleaasit, jotka löydettiin ja puhdistettiin. Molekyylibiologiassa hyödyllisimpiä ovat kuitenkin tyypin II kaltaiset, joita kuvataan seuraavassa osassa.

Tyyppi II

Tyypin II restriktioendonukleaasit tunnistavat spesifisiä DNA-sekvenssejä ja suorittavat katkaisun vakioasennossa lähellä sekvenssiä, joka tuottaa 5'-fosfaatteja ja 3'-hydroksyylejä. Magnesiumioneja tarvitaan yleensä kofaktorina (Mg2+), mutta joitakin niistä on paljon tarkempia vaatimuksia.

Rakenteellisesti ne voivat esiintyä monomeereinä, dimeereinä tai jopa tetrameereinä. Rekombinanttitekniikka käyttää tyypin II endonukleaaseja ja tästä syystä on karakterisoitu yli 3500 entsyymiä.

Tyyppi III

Nämä entsyymijärjestelmät koostuvat kahdesta geenistä, joita kutsutaan mod ja naudanliha, joka koodaa DNA: ta tunnistavat alayksiköt ja muutokset tai rajoitukset. Molemmat alayksiköt ovat välttämättömiä rajoitukselle, prosessi, joka on täysin riippuvainen ATP: n hydrolyysistä.

DNA-molekyylin lohkaisemiseksi entsyymin täytyy olla vuorovaikutuksessa kahden kopion kanssa, joka ei ole palindromisen tunnistuksen sekvenssi, ja kohtien on oltava päinvastaisessa suunnassa substraatilla. Katkaisua edeltää DNA: n translokaatio.

Tyyppi IV

Toinen ryhmä on tunnistettu viime aikoina. Järjestelmä koostuu kahdesta tai useammasta geenistä, jotka koodittavat proteiineja, jotka pilkkovat vain modifioituja DNA-sekvenssejä, olipa se sitten metyloitu, hydroksimetyloitu tai hydrosyloitu glykosyyli.

Esimerkiksi EckKMcrBC-entsyymi tunnistaa kaksi dinukleotidia, joilla on yleinen muoto RmC; puriini, jota seuraa metyloitu sytosiini, joka voidaan erottaa useilla emäsparilla - 40 - lähes 3000. Pilkkominen tapahtuu noin 30 emäsparia sen jälkeen, kun entsyymi tunnistaa.

viittaukset

  1. Burrell, M. M. (toim.). (1993). Molekyylibiologian entsyymit. Totowa, NJ: Humana Press.
  2. Loenen, W. A., Dryden, D. T., Raleigh, E.A. & Wilson, G. G. (2013). Tyypin I restriktioentsyymit ja niiden sukulaiset. Nukleiinihappotutkimus, 42(1), 20-44.
  3. Murray, P.R., Rosenthal, K.S., & Pfaller, M.A. (2017). Lääketieteellinen mikrobiologia + StudentConsult Espanjan + StudentConsultissa. Elsevier Health Sciences.
  4. Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriktioendonukleaasit DNA-molekyylien analysoinnissa ja rakenneuudistuksessa. Biokemian vuosikatsaus, 44(1), 273 - 293.
  5. Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Tyypin II restriktioendonukleaasit: rakenne ja mekanismi. Solu- ja molekyylitieteitä, 62(6), 685.