Agarin YTE n perustaminen, valmistelu ja käyttö



TSI-agari tai rautakolmoissokerin agar on kiinteä viljelyväliaine, joka toimii biokemiallisena testinä Gram-negatiivisten bakteerien alkutunnistamisen ohjaamiseksi. Se perustuu läsnä olevien sokerien käymisen ja vetysulfidin ja kaasun tuotantoon.

Sen koostumus ja säätiö ovat hyvin samankaltaisia ​​kuin Kliglerin rautatesti, sillä jälkimmäinen sisältää vain glukoosia ja laktoosia. Sen sijaan, kuten nimikin kertoo, kolminkertainen rauta-rauta sisältää kolme fermentoitavaa hiilihydraattia: glukoosia, laktoosia ja sakkaroosia..

Lisäksi TSI-väliaineessa on neljä proteiinijohdannaista, jotka tekevät siitä erittäin ravitsevan agarin: hiivauutteen, lihauutteen, peptoni- ja proteoosipeptonin. Se sisältää myös rauta-ammoniumsulfaattia, natriumtiosulfaattia, natriumkloridia, fenolipunaa ja agaria.

Mikro-organismin kyvyttömyys fermentoida väliaineessa läsnä olevaa glukoosia sulkee sen välittömästi pois Enterobacteriaceae-perheeseen. Täten tämä testi on välttämätön, jotta voidaan päättää, mikä tunnistusreitti olisi määritettävä suvun ja lajin määrittämiseksi.

Jokainen laboratorio päättää, toimiiko se TSI-agarilla tai Kligler-agar-agarilla.

indeksi

  • 1 Säätiö
    • 1.1 Natriumkloridi ja agar
    • 1.2 pH-indikaattori (fenoli punainen)
    • 1.3 Proteiinijohdannaiset (hiivauute, lihauute, peptoni ja proteoosipeptoni)
    • 1.4 Hiilihydraattien (glukoosi, laktoosi ja sakkaroosi) fermentointi
    • 1.5 Kaasun tuotanto
    • 1.6 Natriumtiosulfaatti ja rautametalliumsulfaatti (rikkivety) \ t
  • 2 Valmistelu
  • 3 Käyttö
  • 4 Seeded
  • 5 Rajoitukset
  • 6 Viitteet

perusta

Kukin yhdisteistä täyttää toiminnon väliaineessa.

Natriumkloridi ja agar

Natriumkloridi on tarpeen elatusaineen osmoottisen tasapainon ylläpitämiseksi. Vaikka agar antaa kiinteän konsistenssin.

PH-indikaattori (fenoli punainen)

Valmistetun väliaineen pH tasapainotetaan arvoon 7,3 ja pH-indikaattori (fenoli punainen) muuttuu keltaiseksi alle 6.8. Tämä tarkoittaa, että pienet määrät happoja, jotka on tuotettu sokereiden fermentoinnilla, kääntävät väliaineen punaisen oranssista keltaiseksi.

Jos fermentaatiota ei tapahdu, väliaine alkaloituu käyttämällä peptoneja, jolloin punainen-oranssi muuttuu vahvaksi punaiseksi.

Proteiinijohdannaiset (hiivauute, lihauute, peptoni ja proteoosipeptoni)

Kun bakteerit metaboloituvat TSI-agarissa olevista proteiineista, tuotetaan amiinit, jotka emäksevät väliaineen (pääasiassa viistotasolla), koska reaktio tarvitsee happea. Amiinit kääntävät kehyksen vahvaksi punaiseksi.

Mutta tämä riippuu bakteerien kyvystä fermentoida hiilihydraatteja.

Hiilihydraattien (glukoosi, laktoosi ja sakkaroosi) fermentointi

Sokerien fermentoinnin tutkimus voi antaa useita kuvia ja jokainen niistä tulkitaan eri tavalla. Testin tulkinta jakaa mikro-organismit kolmeen luokkaan: ei-glukoosin fermentoijat, ei-laktoosin fermentorit ja laktoosi / sakkaroosin fermentoijat.

On huomattava, että glukoosin määrä väliaineessa on rajoitettu, kun taas laktoosin ja sakkaroosin pitoisuus on 10 kertaa suurempi.

Enterobacteriaceae-perheen bakteerit ja muut glukoosin fermentoivat mikro-organismit alkavat fermentoida tätä sokeria, koska se on energian yksinkertaisin hiilihydraatti..

Toisaalta laktoosi ja sakkaroosi ovat monimutkaisia ​​hiilihydraatteja, jotka on hajotettava ja muutettava glukoosiksi, jotta ne voivat päästä Embden-Meyerhof-sykliin.

-Fermentoimattomat glukoosi-mikro-organismit

Kun inokuloitu mikro-organismi ei kykene fermentoimaan glukoosia, paljon vähemmän voi fermentoida muita hiilihydraatteja. Siksi tässä ei muodostu happoja, mutta viivassa on amiinien muodostumista peptonien käytön vuoksi.

Tässä tapauksessa viisto kääntyy voimakkaammaksi punaiseksi ja putken pohja voi pysyä muuttumattomana tai se voi myös olla alkaloitu, jolloin koko punainen putki jää.

Tulkinta: K / K tarkoittaa emäksistä viisto / alkalista tai neutraalia taustaa

Katso artikkelin alussa olevasta kuvasta putken D kuva.

Tämä tulos osoittaa, että mikro-organismi ei kuulu Enterobacteriaceae-perheeseen.

-Laktoosin / sakkaroosin fermentoimattomat mikro-organismit

Jos bakteerit pystyvät fermentoimaan glukoosia, mutta eivät laktoosia tai sakkaroosia, tapahtuu seuraavaa:

Bakteeri kuluttaa kaiken läsnä olevan glukoosin noin 6 - 8 tunnin kuluttua, jolloin se pystyy happamoittamaan sekä viisteen että tacon; toisin sanoen agar on täysin muuttunut keltaiseksi. Mutta kun glukoosi on loppunut ja kyvyttömyys käyttää laktoosia ja sakkaroosia, bakteerit alkavat proteiinien metaboliaa.

Tämä reaktio tarvitsee happea, joten peptonien hajoaminen tapahtuu pinnalla (viiste). Amiinit tuottivat emäksisen pohjan kääntämällä keltaista punaiseksi. Tämä reaktio osoitetaan 18 - 24 tunnin inkuboinnissa.

Tulkinta: K / A tarkoittaa emäksistä viistoa ja happoa.

Katso artikkelin alussa olevasta kuvasta putken B kuva.

-Laktoosi / sakkaroosi fermentoivat mikro-organismit

Ilmeisesti mikro-organismit, jotka kykenevät fermentoimaan laktoosia ja sakkaroosia, voivat fermentoida glukoosia. Kun väliaineessa oleva vähimmäismäärä glukoosia on käytetty loppuun, muodostunut pyruvaatti metaboloituu muodostaen happoja Krebsin aerobisen syklin kautta, ja 8 - 12 tunnin aikana kaikki väliaine on keltainen.

Jos bakteerit pystyvät jakamaan laktoosia tai sakkaroosia, happoja syntyy edelleen, ja 18 - 24 tunnin kuluttua koko putki - nokka ja taco - pysyvät keltaisina.

On huomattava, että glukoosin käyttö tapahtuu kahdella tavalla: yksi aerobisessa muodossa putken viistossa ja toinen anaerobisesti putken pohjassa.

Tulkinta: A / A tarkoittaa hapan viistoa / happoa. Se voi esittää kaasua tai ei.

Katso artikkelin alussa olevasta kuvasta putken A kuva.

Kaasun tuotanto

Jotkut mikro-organismit kykenevät tuottamaan kaasua sokereiden fermentoinnin aikana. Kaasu osoittaa, että kaasu kohdistuu paineeseen, jonka se aiheuttaa agarin sisällä. Paine aiheuttaa kuplien muodostumisen tai agarin siirtymisen. Joskus kaasun muodostuminen voi murtaa väliaineen.

On tärkeää, että TSI-alustan kylvämisen aikana punkkaus tehdään puhtaana agarin keskellä, kunnes se saavuttaa pohjan. Jos puhkaisu suuntautuu putken seinämiin, se voi aiheuttaa vääriä positiivisia vaikutuksia kaasun tuotannossa, koska se poistuu väärin muodostetun kanavan kautta.

Kaasun tuottaminen sekä agar-viistossa esiintyvät reaktiot tarvitsevat happea, joten on suositeltavaa, että putki peitetään puuvillapistokkeella, ja jos käytetään bakeliittikantaa, sitä ei pidä säätää kokonaan.

Kaasun tuotanto ilmoitetaan positiivisena (+) tai negatiivisena (-).

Natriumtiosulfaatti ja rautamonium- sulfaatti (vetysulfidin tuotanto) \ t

Bakteerit, jotka kykenevät tuottamaan rikkivetyä (väritön kaasu), ottavat väliaineessa olevan natriumtiosulfaatin rikkiä. Kun H on muodostettu2S reagoi rautamonium- sulfaatin kanssa ja tuottaa rautasulfidia (musta saostuma näkyy selvästi).

H: n tuotanto2S ilmoitetaan positiivisena (+) tai negatiivisena (-).

Katso artikkelin alussa olevasta kuvasta putken C kuva.

valmistelu

Punnitaan 62,5 grammaa kuivattua kolminkertaisen sokerin sokeria (TSI) agaria ja liuotetaan yhteen litraan tislattua vettä.

Kuumenna kunnes agari on täysin liuennut. Kiehauta usein sekoittaen. Jaetaan 4 ml elatusainetta 13/100 koeputkessa puuvillan kannella.

Steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Irrota autoklaavista ja anna levätä kaltevalla tavalla. On huolehdittava siitä, että sekä alustan että kehyksen etäisyys on sama.

Säilytä jääkaapissa 2-8 ° C. Annetaan lievittää ennen bakteerikantaa.

Dehydratoidun väliaineen väri on vaalea beige ja valmistettu väliaine on punainen-oranssi

Valmistetun väliaineen lopullinen pH on 7,3 ± 0,2.

sovellukset

YTE-testiä käytetään laajalti mikrobiologian laboratorion tasolla. Tämä testi on välttämätön, jotta voidaan ohjata testityyppiä, jota on sovellettava sukuun ja lajien tunnistamiseen. Sen hyvä toteutus ja tulkinta voivat säästää materiaalia ja työtä.

Jos tulos on TSI K / K ja sytokromioksidaasitesti on positiivinen, on tiedossa, että testejä olisi käytettävä muiden sukupolvien joukossa olevien käymättömien gramnegatiivisten bakteerien, kuten Pseudomonas, Alcaligen, Achromobacter, Burkholderia, tunnistamiseen. Jos se on negatiivinen oksidaasi, se on suunnattu sukuihin Acinetobacter, Stenotrophomonas jne..

Toisaalta, jos saadaan TSI A / A tai K / A ja sytokromioksidaasin testi on negatiivinen, sitä enemmän nitraatteja pelkistetään nitriitteiksi, meillä on varmuutta siitä, että tämä on Enterobacteriaceae-perheeseen kuuluva mikro-organismi. Tällöin tunnistusreitti suuntautuu spesifisiin testeihin tämän bakteeriryhmän osalta.

Toisaalta, jos saadaan K / A- tai A / A-kuva ja sytokromioksidaasi-testi on positiivinen, asennettavat lisätestit ohjataan sellaisten fermentointikantojen tunnistamiseen, jotka eivät kuulu Enterobacteriaceae-perheeseen, kuten: Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio ja Pasteurella.

TSI, jossa on vety- sulfidi, negatiivinen oksidaasi, ohjaa seuraavien Enterobacteriaceae-suvun sukujen tunnistamista: Proteus, Citrobacter, Edwardsiella, Leminorella, Pragia, Trabusiella tai Salmonella.

TSI, jolla on vähäinen tai kohtalainen vetysulfidi emäksisessä viistossa alkalisen pohjan ja positiivisen oksidaasin kanssa, ohjaa testien käyttöä G-negatiivisten, fermentoimattomien bacillojen, jotka tuottavat H2S, kuten Shewanella putrefaciens.

Lopuksi YTE: ää voidaan käyttää vety- sulfidin tuotannon tutkimiseen grampositiivisissa bakteereissa, varsinkin kun epäillään Erysipelothrix rhusiopathiae.

istutettu

TSI-väliaine on inokuloitava puhtailla pesäkkeillä, jotka on eristetty primaarisissa tai valikoivissa viljelmissä. Jos pesäkettä otetaan selektiivisistä väliaineista, jotka on istutettu näytteillä, joissa on sekoitettua kasvistoa, tulee olla varovainen ottamaan vain pinta, koska pesäkkeen alaosassa voi olla elinkelpoisia kantoja, jotka estävät kyseisessä elatusaineessa.

Siksi silmukkaa ei saa koskaan jäähdyttää valikoivassa väliaineessa siirtääkseen sitten pesäkkeen ja siirrostamaan YTE-väliaineen.

Istutus tapahtuu suoralla silmukalla tai neulalla. Punktio tehdään huolehtimalla siitä, että se kulkee keskeltä keskellä kunnes se on alhaalla, ja sitten istutus lopetetaan pinnan sykkiväillä. Älä tee kahta pistettä.

Inkuboidaan 37 ° C: ssa aerobioosissa 18 - 24 tuntia. Tulkitse tällä hetkellä, ei ennen eikä jälkeen.

rajoituksia

YTE-testi on luettava 18–24 tunnin inkubaation aikana. Lukema ennen tätä aikaa voi antaa väärän positiivisen fermentaation A / A. Kun tämän ajan kuluttua lukeminen voi aiheuttaa väärän negatiivisen kuvan ei-fermentorista, koska väliaineiden emäksinen peptoni on kulutettu.

viittaukset

  1. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti merkittävien bakteerien tunnistamiseksi. 3. ed. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires Argentiina.
  2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scottin mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana S.A. Argentiina.
  3. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5th ed. Toimituksellinen Panamericana S.A. Argentiina.
  4. "TSI-agari." Wikipedia, vapaa tietosanakirja. 10. heinäkuuta 2018, 08:09 UTC. 10. helmikuuta 2019, 03:33 Saatavilla osoitteessa: en.wikipedia.org
  5. Laboratories Britania. TSI-agari (kolminkertainen sokerirauta). 2015. Saatavilla: britanialab.com
  6. BD Laboratories Kolmen sokerin rauta-agari (TSI Agar). 2003. Käytettävissä: bd.com