Agar Müeller Hintonin perusta, valmistus ja käyttö

Müeller Hintonin agar Se on kiinteä, ei-selektiivinen ravintoaine, joka koostuu lihan infuusiosta, kaseiinihappopeptonista, tärkkelyksestä, agarista ja tislatusta vedestä. Tämä väliaine mahdollistaa erinomaisen mikrobiologisen kehityksen nopeasti kasvavilla bakteereilla.

Alun perin luonut John Howard Müeller ja Jane Hinton eristämään ravitsemuksellisesti vaativia bakteereita, kuten Neisseria gonorrhoeae ja Neisseria meningitidis. Ominaisuuksiensa vuoksi se osoittautui kuitenkin ihanteelliseksi antibiooteille alttiuden tutkimiseksi, mikä antoi luotettavia ja toistettavia tuloksia.

Tästä syystä Müeller Hintonin agar on Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ja Euroopan antimikrobisen altistumistestin komitean hyväksymä viljelyalusta antimikrobisen herkkyystestin suorittamiseksi Kirby-levyn diffuusiomenetelmällä. Bauer.

indeksi

• 1 Säätiö
• 2 Valmistelu
• 3 Käyttö
  • 3.1 Antimikrobinen tekniikka
  • 3.2 Levyjen strateginen sijoittaminen Müeller Hintonin agariin
• 4 Virheellisten tulosten syyt
• 5 Rajoitus
• 6 Laadunvalvonta
• 7 Viitteet

perusta

Koska se on ei-selektiivinen ravintoaine, se sopii erinomaisesti useimpien patogeenisten bakteerien kasvuun.

Toisaalta sen yksinkertainen koostumus saa aineet helposti leviämään siihen, mikä on levyn diffuusiomenetelmällä herkkyystestille olennainen ominaisuus..

Toinen sen ominaisuuksista on se, että se sisältää pienen määrän inhibiittoreita, jotka mahdollistavat sulfonamidien, trimetopriimin ja tetrasykliinien tehokkaan arvioinnin..

On kuitenkin pidettävä mielessä, että väliaineen on täytettävä tietyt edellytykset sen moitteettoman toiminnan varmistamiseksi, mukaan lukien:

PH-säätö, agarin syvyys ja riittävä tymiini-, tymidiini-, Ca-pitoisuus⁺⁺, mg⁺⁺ ja Zn⁺⁺.

Meidän on myös tiedettävä, että menetelmät ovat standardoituja ja siksi kaikki parametrit on täytettävä, kuten:

Inokulaatin pitoisuus, antibioottilevyjen pitoisuus ja säilyttäminen, sopivan lukumäärän levyjen sijoittaminen agariin, yhden levyn ja toisen välinen etäisyys, tiettyjen antibioottien strateginen sijoittelu, ilmakehä, lämpötila ja aika. itämisaika.

valmistelu

Punnitaan 37 g kuivattua Müeller Hinton -liuosta ja liuotetaan 1 litraan tislattua vettä. Kuumenna väliaine samalla sekoittaen sen liuottamiseksi. Anna kiehua 1 minuutti.

Autoklaavi steriloidaan 121 ° C: ssa 15 minuuttia. Autoklaavista poistettaessa fiola on sijoitettava vesihauteeseen 50 ° C: seen jäähtymään. Kaada 25-30 ml steriileihin Petri-maljoihin, joiden halkaisija on 10 cm.

Levyjen keskipaksuuden tulisi olla 4 mm (ihanteellinen), sallittu 3-5 mm.

Jos halutaan valmistaa veriagaria käyttäen Müeller Hintonin agaripohjaa, kaadetaan 5% steriiliä ja defibrinoitua karitsan verta ennen annostelua levyille..

Väliaineen lopullisen pH: n tulisi olla 7,2 - 7,4.

Investoi ja säilytä jääkaapissa ennen käyttöä. Anna levyn ottaa huoneenlämpötila ennen käyttöä.

Valmistetun väliaineen väri on vaalea beige.

sovellukset

Sitä käytetään antibiootti- tai antibioottiherkkyystestin suorittamiseen useimmille ei-nopeasti kasvaville patogeeneille.

Jos agaria täydennetään verellä, se toimii vaativien mikro-organismien, kuten: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus sp, Neisseria meningitidis, muun muassa. Sitä on myös käytetty eristämään Legionella pneumophila.

Antibiogrammin tekniikka

Ennen antibiootin suorittamista on valmistettava 1,5 x 10: n ekvivalentti bakteeriliuos⁸ solu.

Tätä varten puhtaasta viljelmästä otetaan 3 - 4 pesäkettä ja suspendoidaan tripticase soijaliemeen tai Müeller Hinton -liemessä, inkuboidaan 2 - 6 tuntia ja konsentraatio säädetään steriilillä suolaliuoksella vertaamalla sitä Mac Farland -standardiin. 0,5%.

Jos ne ovat vaativia mikro-organismeja, pesäkkeet voidaan keskeyttää suoraan, kunnes ne saavuttavat 0,5%: n Mac Farlandin pitoisuuden. Myöhemmin Müeller Hinton -levy kylvetään valmistetulla bakteeriliuoksella kyllästetyllä vanupuikolla.

Tätä varten kastele vatka liuokseen ja poista sitten ylimääräinen neste painamalla putken seinämiä. Välittömästi sen jälkeen, kun vanupuikko on läpäissyt koko pinnan, ei jätä koskemattomia kohtia, pyöritä sitten hieman levyä ja kylvetään uudelleen. Toisto toistetaan vielä 2 kertaa.

Anna seistä 10 minuuttia ja aseta antibioottilevyt steriileihin pihteihin, jolloin niiden väliin jää tilaa 24 mm. Sen jälkeen, kun kukin levy on asetettu agariin, kukin niistä on kiinnitetty kevyesti kiinnittimellä varmistaaksesi, että ne ovat hyvin kiinni.

Prosessin jälkeen levy käännetään ja inkuboidaan 35 - 37 ° C: ssa aerobioosissa 16 - 18 tuntia. Jos se on vaativa mikro-organismi, se voi vaatia mikroerofiliaa ja jos antibiootti sisältää oksasilliinilevyjä, se on luettava 24 tuntia..

Hallitsijaa käytetään kunkin halogeenin halkaisijan mittaamiseen. Tulokset on kirjattava millimetreinä. Myöhemmin saadut arvot korreloidaan nykyisten CLSI-käsikirjan julkaisemien leikkauspisteiden taulukoiden kanssa.

Ilmoita tapauksen mukaan herkäksi (S), välituotteeksi (I) tai kestäväksi (R).

Antibiootit valitaan eristetyn mikro-organismin ja esiintyvän infektiotyypin mukaan.

Joskus antibioottien strateginen sijoittelu olisi katsottava osoittamaan fenotyyppisiä resistenssimalleja.

Levyjen strateginen sijoittaminen Müeller Hintonin agariin

Enterobakteerien osalta klavulaanihappolevy on sijoitettava kolmannen ja neljännen sukupolven kefalosporiinien eteen. Muna-muotoinen laajeneminen osoittaa, että kanta on laajennetun spektrin beeta-laktamaasien (ESBL) tuottaja. Tämä tarkoittaa, että potilasta ei saa hoitaa kefalosporiinilla.

Staphylococcusissa on tärkeää sijoittaa erytromysiini- tai atsitromysiinilevy klindamysiinilevyn eteen (D-testi).

Erytromysiinissä oleva resistentti halo ja klindamysiini-halogeenin litistyminen osoittavat, että kannalla on indusoituva resistenssi klindamysiinille, kannalle (RIC). Tämä tarkoittaa, että hoito klindamysiinillä ei ole tehokasta.

Indusoituvien AMP C-kantojen etsimiseksi Enterobacteriaceaessa ja eräissä ei-fermentoivissa Gram-negatiivisissa bakteereissa, ceftazidimin, kefoksitiinin tai piperatsiini-tazobaktaanin levyillä on 27 mm: n etäisyys imipeneemilevystä..

Yksi imipeneemiin päin olevista levyistä litistetty halo osoittaa indusoituvan AMP C: n läsnäolon.

Konstitutiivisen AMP C: n etsimiseksi cloxacillin 500 μg: n levy on keftatsidiimin (30 μg) ja kefotaksiimin (30 μg) kanssa 25 mm: n etäisyydellä. Laajennettu halogeeni jollakin kefalosporiineista osoittaa positiivisuutta.

Cloxacillin-levy voidaan myös korvata 9 mm: n levyisellä Whatman No. 6 -suodatinpaperilla, joka on kyllästetty fenyyliboronihapolla (400 μg) ja jonka etäisyys on 18 mm. Se tulkitaan samalla tavalla kuin edellinen.

Lopuksi, tutkitaan metallo-beeta-laktamaasien tuotantoa, erityisesti Pseudomonas aeruginosa, levyä, joka on kyllästetty 10 μl: lla etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA 750 μg) ja tioglykolihappoa (SMA 300 μg), joka on imipeneemin ja meropeneemilevyjen edessä, käytetään 15 mm: n etäisyydellä.

Testi on positiivinen, jos imipeneemi tai meropeneemihalos laajenee kohti EDTA / SMA-levyä. Tämä tulos on vahvistettava muutetulla Hodge-testillä.

Tämä menetelmä käsittää inokuloimisen Escherichia coli ATCC 25922 Müeller Hinton -levyllä. Imipeneemilevy asetetaan levyn keskelle ja sitten levystä valmistetaan huilu periferiaa kohti. P. aeruginosa epäilyttävä. Voit testata jopa 4 kantaa levyä kohti.

Testi on positiivinen, jos imipeneemin halo on vääntynyt vyöhykkeen ympärille.

Virheiden tulosten syyt

-Huonosti säilöttyjen antibioottien levyt voivat aiheuttaa vääriä vastuksia. Esimerkiksi oksasilliinilevy on hyvin herkkä lämpötilan muutoksille.

-Ilmoitetun väliaineen (happo) pH alentaa aminoglykosideissa ja makrolideissa pienempiä haloja (väärien resistenssien riski) ja suurempia haloja penisilliinissä, tetrasykliinissä ja novobiosiinissa (väärän herkkyyden riski).

-Jos pH on ilmoitetun (emäksisen) yläpuolella, edellä kuvatut vaikutukset käännetään.

-Elatusaineet, joilla on korkea tymiini- ja tymidiinikonsentraatio, vähentävät merkittävästi sulfonamidien ja trimetopriimin inhibitiohalogeeneja.

-Kalsiumin ja magnesiumin korkeat pitoisuudet aiheuttavat aminoglykosidien, polymyksiini B: n ja tetrasykliinien vääriä resistenssejä \ t Pseudomonas aeruginosa.

-Kalsiumin ja magnesiumin alhaiset pitoisuudet tuottavat aminoglykosidien, polymyksiini B: n ja tetrasykliinien vääriä herkkyyksiä \ t Pseudomonas aeruginosa.

-Sinkin esiintyminen vaikuttaa karbapeneemilevyjen (imipeneemi, meropeneemi ja ertapeneemi) tuloksiin.

-Alle 3 mm: n väliaineen paksuus tuottaa virheellisiä tuloksia, kun taas paksuus yli 5 tuottaa väärän vastarinnan.

-Levyjen mobilisointi antibiootissa antaa epämuodostuneita haloja, koska antibioottien purkautuminen on välitöntä.

- Hyvin heikot inokulaatit vaikuttavat tuloksiin, koska agarissa ei ole yhtenäistä tai konfluenttia kasvua, mikä on välttämätön edellytys estämisalueiden mittaamiseksi sen lisäksi, että haloilla voi olla suurempi kuin normaali.

-Ylikuormitetut inokulaatit voivat antaa haloille normaalia pienempiä.

-Levyjen välisen etäisyyden noudattamatta jättäminen aiheuttaa yhden halon päällekkäisyyden toiselle eikä sitä voi lukea oikein.

-Inkuboidaan CO: n kanssa₂ lisää tetrasykliini- ja metisilliinilevyjen halojen kokoa.

-Inkubointi lämpötiloissa, jotka ovat alle 35 ° C, tuottaa suurempia haloja.

-Veren lisääminen pienentää sulfonamidien halogeenikokoa.

rajoitus

Antibiootin herkkyys antibiootissa mikro-organismia vastaan ​​(in vitro) ei takaa, että se toimii in vivo.

Laadunvalvonta

Jos haluat tietää, sisältääkö väliaine oikean määrän tymiiniä, kannattaa kylvää kanta Enterococcus faecalis -valmistetta ATCC 29212 ja testaa herkkyys trimetopriimi sulfametoksatsolille (SXT), sen pitäisi antaa tyydyttäväksi halo, joka on vähintään 20 mm..

viittaukset

1. "Agar Müller-Hinton." Wikipedia, vapaa tietosanakirja. 16. marraskuuta 2018, 12:23 UTC. 27. tammikuuta 2019, 04:22
2. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scottin mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana S.A. Argentiina.
3. Cona E. Edellytykset hyvän herkkyystutkimuksen suorittamiseksi agar-diffuusiotestillä. Rev Chil Infect, 2002; 19 (2): 77-81
4. Difco Francisco Soria Melguizo -laboratorio. Müeller Hintonin agar, jossa oli 5% lampaan verta. 2009. Saatavilla osoitteessa: http://f-soria.es
5. BD Müeller Hinton II Agarin laboratorio. 2017. Saatavilla osoitteessa: .bd.com
6. Laboratories Britania. Müeller Hintonin agar. 2015. Saatavilla: britanialab.com
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5th ed. Toimituksellinen Panamericana S.A. Argentiina.
8. Martínez-Rojas D. Betalactamasas tyyppi AmpC: Yleiset ja menetelmät fenotyyppiseen havaitsemiseen. Soc. Ven. Microbiol. 2009; 29 (2): 78-83. Saatavilla osoitteessa: scielo.org.
9. Perozo A, Castellano M, Ling E, Arraiz N. Metallobetalaktamaasien fenotyyppinen havaitseminen kliinisissä isolaateissa Pseudomonas aeruginosa. Kasmera, 2012; 40 (2): 113-121. Saatavilla osoitteessa: scielo.org.