Agarilla on vakio, valmistus ja käyttö



tavallinen tilin agar on kiinteä, ei-selektiivinen viljelyväliaine, joka on suunniteltu juomaveden, jäteveden, maidon juomien näytteissä esiintyvän aerobisen mikrobikuorman kvantifiointiin muiden elintarvikkeiden joukossa. Tämä väliaine tunnetaan myös nimellä PCA-agari, sen lyhenteestä englanninkielisessä levynluku- agarissa. Se perustettiin vuonna 1953 Buchbinder, Baris ja Goldstein.

Tavallinen agar-väliaine-tili koostuu hiivauutteesta, tripteiinistä, glukoosista, agarista ja tislatusta vedestä. Tämä formulaatio sisältää perustarpeita, jotka mahdollistavat nykyisen aerobisen mikrobikuorman kehittymisen, ei vaativa.

Koska elatusaine ei sisällä inhibiittoreita, bakteerit voivat kehittyä ilman rajoituksia, joten se on ihanteellinen yleistä pesäkkeiden määrää varten. Levyn kvantifiointitekniikka ei kuitenkaan tunnista kaikkia läsnä olevia bakteereja, vaan vain niitä, jotka pystyvät kasvamaan ympäristöolosuhteissa, joihin standardi kylvetty agari altistetaan..

Tässä mielessä levyn kvantifiointitekniikalla pyritään määrittämään yleisesti aerobisten mesofiilisten bakteerien määrä, toisin sanoen ne, jotka kehittyvät 25 - 40 ° C: n lämpötiloissa, optimaalisen kasvulämpötilan ollessa 37 ° C: ssa..

Tämä bakteeriryhmä on erittäin tärkeä, koska ihmisillä on useimmat patogeeniset bakteerit.

On huomattava, että joskus voi olla mielenkiintoista määrittää elintarvikkeissa esiintyvien psykofiilisten bakteerien määrä. Nämä bakteerit ovat sellaisia, jotka kehittyvät alhaisissa lämpötiloissa (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Samoin termofiiliset bakteerit, jotka kehittyvät alueella 50 ° C - 80 ° C tai enemmän, voivat olla tärkeitä tietyntyyppisissä elintarvikkeissa, kuten säilykkeissä.

Mikrobien kvantifiointi ilmaistaan ​​pesäkkeitä muodostavissa yksiköissä (CFU) grammaa kohti tai millilitraa näytettä.

indeksi

  • 1 Säätiö
  • 2 Valmistelu
    • 2.1 Levyvalutekniikkaa varten
    • 2.2 Pinnan istutukseen
  • 3 Käytä
    • 3.1 Levyn kaatamistekniikka (syvyys)
    • 3.2 Pinnalle kylvetty tekniikka
  • 4 Laadunvalvonta
  • 5 Rajoitukset
  • 6 Viitteet

perusta

Normaali laskentaväline on suunniteltu sallimaan ei-vaativien aerobisten bakteerien tyydyttävä kehitys, koska hiivauute, tripheiini ja glukoosi tarjoavat tarvittavat ravintoaineet hyvälle mikrobien kehittymiselle.

Toisaalta elatusaineella on selkeä väri ja läpinäkyvä ulkonäkö, minkä vuoksi se on ihanteellinen syvän kylvön menetelmällä kehitettyjen pesäkkeiden esittämiseen (lautaselle kaataminen)..

On myös mahdollista laskea pesäkkeet kylvömenetelmällä pinnalla Drigalskin lastalla.

Kun mikrobikuormitus on korkea, on tutkittavan näytteen desimaaliliuokset tehtävä CFU: iden laskemiseksi.

On huomattava, että amerikkalainen kansanterveysyhdistys (APHA) suosittelee tätä väliainetta aerobisten mesofiilien laskemiseen.

valmistelu

Punnitaan 23,5 g kuivattua väliainetta ja liuotetaan yhteen litraan tislattua vettä. Seoksen täydelliseen liukenemiseen on kuumennettava sekoittaen usein, kunnes se kiehuu. Seuraavat vaiheet riippuvat käytettävästä kylvötekniikasta.

Levyvalutekniikkaa varten

Levitä jakamalla 12 - 15 ml koeputkiin. Sen jälkeen steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuuttia. Annetaan kiinteytyä pystysuoraan lohkon muodossa. Säilytä jääkaapissa ennen käyttöä.

Sulata kierros, kun sitä käytetään. Kun se on sulanut, pidä se vesihauteessa 44-47 ° C: ssa, kun näytteitä valmistetaan.

Istutettavaksi pinnalle

Steriloidaan väliaine autoklaavissa 121 ° C: ssa ja sitten jaetaan 20 ml steriileihin petri-astioihin. Anna jähmettää, kääntää ja säilyttää jääkaapissa ennen käyttöä.

Lämmitä levyt ennen käyttöä. Väliaineen pH: n tulisi olla 7,0 ± 0,2.

käyttö

Agarin standardilukua käytetään aerobisessa mesofiililukumenetelmässä veden ja ruoan mikrobiologisen analyysin aikana. Aerobisten mesofiilien laskeminen on välttämätöntä, koska se määrittää tutkittavan näytteen terveyslaadun.

Tämän tekniikan soveltaminen (käyttäen tätä väliainetta) sallii eristettyjen pesäkkeiden makroskooppisen visualisoinnin niiden kvantifioimiseksi.

Plakin kaatamistekniikka (syvyys)

-prosessi

Tekniikka koostuu seuraavista:

1) Homogenisoi näyte läsnä olevien bakteerien uudelleen jakamiseksi.

2) Alkuperäinen suspensio suoritetaan steriilissä injektiopullossa tai pussissa ottaen huomioon suhde 10 g tai 10 ml näytettä 90 ml: ssa laimennusainetta (10-1).

3) Alkuperäisestä suspensiosta tehdään asianmukaiset desimaaliliuokset näytteen tyypistä riippuen. Esim. (10-2, 10-3, 10-4). Laimennukset tehdään peptonivedellä tai fosfaattipuskurilla.

Tätä varten ota 1 ml alkususpensiota ja laita 9 ml: aan laimennusainetta, jatka laimennuksia tarvittaessa ja ota nyt 1 ml laimennosta.-2 ja niin edelleen.

4) Ota 1 ml kutakin laimennosta ja laita tyhjiin steriileihin Petri-maljoihin.

5) Lisätään jokaiseen levyyn 12 - 15 ml tavallista agar-agaria, joka on aiemmin sulanut ja asetettu 44 - 47 ° C: seen.

6) Anna tasaiset pyörivät liikkeet levyille, jotta näyte jaetaan agariin tasaisesti ja annetaan jähmettyä.

7) Käännä levyt ja inkuboi 37 ° C: ssa aerobioosissa 24 - 48 tunnin ajan.

8) Kun aika on päättynyt, jatka levyjen tutkimista ja laskee pesäkkeet laimennetussa liuoksessa. Se valitaan niiden levyjen laskemiseen, joissa on välillä 30 - 300 CFU.

Laskenta voidaan tehdä manuaalisesti tai voidaan käyttää pesäkkeiden laskurilaitteistoa.

Näytteen millilitraa kohden sallitut arvot voivat vaihdella maittain niiden normien mukaan, joilla niitä säännellään.

-UFC: n laskeminen

Yleinen laskenta tehdään seuraavalla kaavalla:

Ilmoittakaa tulokset 1 tai 2 numerolla kerrottuna sopivalla pohjalla 10. Esimerkki: jos tulos on 16,545, se pyöristetään kolmannen numeron perusteella 17.000: een ja se ilmaistaan ​​seuraavasti: 1,7 x 104. Nyt, jos tulos oli 16 436 on pyöristetty 16 000: een ja se ilmaistaan ​​1,6 x 104.

Tekniikka istutetaan pinnalle

-prosessi

-Inokuloidaan 0,1 ml: lla suoraa näytettä, jos se on nestemäistä, alustava suspensio 10-1 tai peräkkäisistä laimennoksista 10-2, 10-3 jne., tavallisen tilin agar-levyn keskellä.

-Levitä näyte tasaisesti Drigalski-lastalla tai L-muotoisella lasitangolla ja anna seistä 10 minuuttia.

-Käännä levyt ja inkuboi aerobioosissa 37 ° C: ssa 24–48 tuntia.

-Jatka kolonioiden laskemista, valitse ne levyt, jotka ovat välillä 20 - 250 CFU.

-UFC: n laskeminen

Laskennassa käytetään laimennuskerrointa, joka on käänteinen. Numero pyöristetään kahteen merkitsevään numeroon (pyöristetään kolmannen numeron mukaan) ja se ilmaistaan ​​perusyksikön 10 tehona.Jos esimerkiksi 224 CFU lasketaan näytteessä ilman laimennusta (10-1), Raportoidaan 22 x 101  UFC, mutta jos luku oli 225, ilmoitetaan 23 x 101 UFC.

Jos olet laskenut 199 CFU: ta laimennuksessa 10-3, 20 x 10 ilmoitetaan4 UFC, mutta jos 153 CFU lasketaan samassa laimennoksessa, raportoidaan 15 x 104 UFC.

Laadunvalvonta

Standardiluku-viljelyalusta voidaan arvioida käyttäen tunnettuja sertifioituja kantoja, kuten: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Jos viljelyväliaine on optimaalisissa olosuhteissa, odotetaan tyydyttävää kasvua kaikissa tapauksissa lukuun ottamatta L. fermentum joka voi olla säännöllinen.

Viljelyalustan steriiliyden arvioimiseksi jokaisen valmistetun erän yksi tai kaksi levyä (inokuloimaton) tulisi inkuboida 37 ° C: ssa aerobioosissa 24 tunnin ajan. Tämän ajan kuluttua väliaineen kasvua tai värinmuutosta ei tulisi tarkkailla..

rajoituksia

-Älä sulaa agaria useammin kuin kerran.

-Valmistettu väliaine voi kestää jopa 3 kuukautta niin kauan kuin sitä säilytetään jääkaapissa ja suojataan valolta.

-Tämä väliaine ei sovellu vaativiin mikro-organismeihin eikä anaerobeihin.

viittaukset

  1. Lääkelaitosten elintarvike- ja lääketieteellinen tekniikka (ANMAT). Elintarvikkeiden mikrobiologinen analyysi, virallinen analyysimenetelmä, indikaattori-mikro-organismit. 2014 Volume 3. Saatavilla osoitteessa: anmat.gov.ar
  2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Plate Count Agar. 2009. Saatavilla osoitteessa: http://f-soria.es
  3. Laboratories Conda Pronadisa. Agar standardimenetelmille (PCA) APHA: n ja ISO 4833. mukaisesti. Saatavana osoitteessa: condalab.com
  4. Laboratories Britania. Laske agar-levylle. 2015. Saatavilla: britanialab.com
  5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B ja Velázquez O. 2009. Elintarvikkeiden mikrobiologisen analyysin tekniikat. 2nd ed. Kemian tiedekunta, UNAM. Meksikossa. Saatavilla osoitteessa: depa.fquim.unam