DNA-sekvensointi Maxam-Gilbert, Sanger-menetelmä, esimerkkejä



DNA-sekvensointi (deoksiribonukleiinihappo) on menetelmä, joka suoritetaan molekyylibiologian laboratorioissa ja joka mahdollistaa nukleotidien järjestyksen tuntemisen kiinnostavassa geneettisessä materiaalissa. Lisäksi RNA: n sekvensointi (ribonukleiinihappo) voidaan myös paljastaa.

Tämä tekniikka on ollut välttämätön biologisten tieteiden kehittämisessä. Sitä voidaan soveltaa myös muilla osaamisalueilla - esimerkiksi lääketieteellisen diagnoosin ja rikosteknisten tutkimusten yhteydessä.

Aikaisemmin DNA-juosteen sekvensointi katsottiin hitaaksi ja kalliiksi aktiivisuudeksi, joka mahdollisti vain muutaman emäsparin tunnistamisen oligonukleotideissa.

Nykyään tieteen edistyksellä DNA-sekvensointi on rutiinitoiminta monissa laboratorioissa maailmanlaajuisesti lähes 50 vuoden tutkimuksen ansiosta tällä alalla. Ketjun pituuden suhteen voit järjestää jopa miljoonia peruspareja hyvin lyhyessä ajassa.

Tätä varten on kehitetty kymmeniä tekniikoita, jotka vaihtelevat hinnan ja tarkkuuden mukaan. Tässä artikkelissa kuvataan sekä klassisia että nykyaikaisia ​​tekniikoita, joista jokaisella on etuja ja haittoja.

Toistaiseksi sekvensointitekniikat mahdollistavat täydellisten genomien sekvenssin saamisen pienistä prokaryooteista ja hiivoista ihmisen genomiin.

indeksi

  • 1 DNA: n rakenne
  • 2 Historia
  • 3 Sanger-menetelmä
    • 3.1 Reaktion pääkomponentit
    • 3.2 Tulosten lukeminen
  • 4 Automaattinen sekvensointi
  • 5 Maxam-Gilbert-sekvensointi
    • 5.1 Menettely
    • 5.2 Tulosten lukeminen
  • 6 Massiivinen sekvensointi
    • 6.1 Pyrosekvensointi
    • 6.2 Sekvensointi synteesillä
    • 6.3 Sekvensointi ligaatiolla
    • 6.4 Ion Torrentin sekvensointi
  • 7 Esimerkkejä
    • 7.1 Ihmisen genomin sekvensointi
  • 8 Tärkeys ja sovellukset
  • 9 Viitteet

DNA: n rakenne

DNA-sekvensointiin käytettävien menetelmien ja tekniikoiden ymmärtämiseksi on tarpeen tietää tietyt molekyylin rakenteen ja koostumuksen keskeiset näkökohdat.

DNA on biomolekyyli, joka löytyy kaikista elävistä asioista, bakteereista suuriin vesieläimiin. Organellit - kuten mitokondriot ja kloroplastit - sisältävät niiden sisällä ympyränmuotoisen DNA-molekyylin. Jopa joissakin viruksissa löydetty geneettinen materiaali on DNA.

Rakenteellisesti DNA on nukleotidien joukko. Kukin niistä on integroitu hiilihydraatilla, typpipohjalla (A, T, C tai G) ja fosfaattiryhmällä. DNA-sekvensoinnin tavoitteena on paljastaa järjestys, jossa neljä typpeä emästä löytyy sekvenssistä.

historia

1950-luvun puolivälissä tutkijat Watson ja Crick kuvailivat DNA: n rakennetta käyttäen kristologisia tekniikoita. Yksikään näistä tutkijoista ei kuitenkaan kyennyt löytämään keinoja sekvenssin paljastamiseksi.

Vaikka oli olemassa joitakin edeltäjiä, tärkein tapahtuma oli Sangerin menetelmän luominen vuonna 1977. Menetelmän isä Frederick Sanger oli brittiläinen biokemisti, joka voitti kaksi Nobelin palkintoa valtavista panoksistaan ​​biologisiin tieteisiin.

Tämä tekniikka tunnetaan myös kirjallisuudessa "ketjun päätteeksi" tai dideoksinukleotideiksi. Seuraavaksi kuvataan tämän tekniikan periaatteita ja niitä, jotka on kehitetty tämän parantamisen ja innovoinnin perusteella.

Sangerin menetelmä

Sangerin menetelmän kehittäminen oli ratkaiseva tapahtuma molekyylibiologiassa. Se sisältää DNA-replikaatioprosessin peruskomponentit, jotka normaalisti esiintyvät solussa, mutta lisäämällä erityinen komponentti: dideoksinukleotidit.

Reaktion pääkomponentit

- DNA-polymeraasi: DNA-polymeraasin entsyymi on olennainen osa prosessia. Tämä molekyyli osallistuu DNA-juosteen replikointiin ja sen rooli on uuden ketjun synteesi, joka vastaa deoksiribonukleotiditrifosfaattia komplementaaristen kanssa..

Muista, että DNA: ssa tymiinit (T) yhdistetään adeniinien (A) kanssa kahden vety- sidoksen avulla, kun taas sytosiini (C) tekee guaniinin (G) kanssa kolme siltaa.

- Nukleotidit: Sanger-sekvensointi käsittää kaksi nukleotidityyppiä, neljä 2'-deoksinukleotidia (lyhennettynä dATP, dGTP, dCTP ja dTTP) ja neljä dideoksinukleotidia (ddATP, ddGTP, ddCTP ja ddTTP).

Vaikka dideoksinukleotidit ovat samankaltaisia ​​kuin monomeerit, jotka normaalisti sisällytetään DNA: han, niillä ei ole -OH-ryhmää niiden rakenteessa. Tämän vuoksi uuden nukleotidin lisääminen ketjuun on mahdotonta.

Siksi, kun lisätään erityinen nukleotidi - täysin satunnaisesti - muodostuvaan ketjuun, synteesi on halvaantunut. Tällä tavalla reaktion lopussa on eri kokoisia ketjuja, joista kukin on pysäytetty eri kohdassa.

Kokeellisesti tehdään neljä koetta. Kukin sisältää DNA: ta, joka on uutettu kiinnostavasta biologisesta näytteestä, normaaleista nukleotideista ja yhdestä erityisistä nukleotidityypeistä. Tai erityiset nukleotidit on merkitty jonkin tyyppisellä fluoresoivalla merkkiaineella (katso alla automatisoitu sekvensointi).

Tulosten lukeminen

Ensimmäinen vaihe on erottaa jokainen syntetisoitu ketju niiden koon mukaan. Jotkut ovat pidempiä kuin toiset, riippuen siitä, mihin erikoisalustat on otettu.

On olemassa erilaisia ​​biokemiallisia tekniikoita, jotka mahdollistavat seoksen komponenttien erottamisen käyttäen koon syrjivänä ominaisuutena. Sanger-menetelmässä eri ketjut erotetaan elektroforeesilla. Tekniikan kehittyneimmissä muunnoksissa käytetään kapillaarielektroforeesia.

Niinpä pidemmät säikeet liikkuvat vähemmän kuin lyhyemmät variantit. Sitten tämä järjestelmä kulkee lukijan läpi, joka tunnistaa kussakin dideoksinukleotidissa olevan markkerin. Tällä tavalla sekvenssin järjestys voidaan tunnistaa.

Tämä "ensimmäisen sukupolven" tekniikka pystyy lukemaan DNA-fragmentteja, jotka eivät ole suurempia kuin 1 kilobaseja. Tällä hetkellä Sangerin menetelmää käytetään useissa laboratorioissa, yleensä nykyaikaisissa muunnoksissa. Lisäksi sitä käytetään vahvistamaan tulokset, jotka on saatu monimutkaisimmilla tekniikoilla - mutta vähemmän tarkkoja.

Automaattinen sekvensointi

Kun tarvitaan laajamittaista sekvensointia, prosessi nopeutuu automaatiolla. Tämä on Sanger-ketjun päättymismenetelmän muunnelma, jossa alukkeet on merkitty fluoresoivilla tuotteilla niiden erottamiseksi.

Tämän jälkeen reaktion tuote ajetaan elektroforeesissa - kaikki yhdellä kaistalla. Kun jokainen fragmentti lähtee geelin lopullisesta osasta, se tunnistetaan nopeasti sen fluoresoivan leiman avulla, jonka virhe ympäröi 1%.

Kehittyneimmissä järjestelmissä on järjestelmä, jossa on jopa 96 kapillaariputkea, joita käyttää tietokone, joka on kytketty robottiin. Toisin sanoen 96 DNA-näytettä voidaan arvioida samanaikaisesti. Siten prosessi, joka käsittää elektroforeesin ja tulosten analyysin, on täysin automatisoitu.

Yhdessä päivässä nämä järjestelmät voivat järjestää jopa 550 000 emästä. Prosessin aikana ihmisen työ on tarpeeton, menetelmän käynnistäminen kestää vain noin 15 minuuttia.

Maxam-Gilbertin sekvensointi

Samalla Sanger julkaisi työnsä, kaksi tutkijaa Allan Maxan ja Walter Gilbert onnistui kehittämään toisen menetelmän DNA-sekvenssin saamiseksi. Menetelmä sai tuolloin suosiota, mutta Sangerin menetelmän parantaminen siirtyi myöhemmin.

Toisin kuin Sangerin menetelmässä, Maxanin ja Gilbertin sekvensointi (tai kemiallinen sekvensointi, kuten on myös tiedossa) ei sisällä hybridisaatioreaktioita. Menetelmä koostuu merkinnöistä reaktiivisilla aineilla toisessa päässä, jota seuraa puhdistusprosessi.

Yksi tämän tekniikan negatiivisista seikoista on sen valtava monimutkaisuus ja käyttäjälle vaarallisten kemikaalien käyttö. Kemialliset hajoamiset indusoidaan käyttämällä DMS: ää, muurahaishappoa, hydratsiinia ja hydratsiinia suolojen kanssa.

prosessi

Protokolla alkaa merkinnällä nauhan 5'-päässä fosforimarkkerilla 32, sitten tapahtuu typpipohjaisen kemiallisen modifioinnin tapahtuminen ja se erotetaan. Lopuksi tapahtuu abasic-alueen jakautuminen.

Ensin sekvensoitava ketju lyhennetään pienemmiksi segmenteiksi. Tämä vaihe suoritetaan restriktioentsyymeillä, jotka johtavat erinomaisiin ääripäihin.

Seuraavaksi reaktio suoritetaan alkalisella fosfataasilla, jonka tarkoituksena on poistaa fosfaattiryhmä. Siten polynukleotidikinaasia voidaan käyttää leimauksen suorittamiseen.

Ketju on denaturoitu (kaksi säiettä auki). Sitten jatkamme kemikaalien soveltamista. Nämä katkaisureaktiot suoritetaan kontrolloidusti ja minkä tyyppiset sidokset rikkoutuvat jokaisen kemikaalin ollessa kyseessä.

Tulosten lukeminen

Kuten Sanger-menetelmässä, tulosten lukemiseen kuuluu elektroforeesijärjestelmässä saatujen ketjujen erottaminen koon mukaan. Polyakryyliamidista koostuvat järjestelmät mahdollistavat hyvin riittävän resoluution geelin lukemista varten.

Massiivinen sekvensointi

Massiivinen sekvensointi kattaa joukon uusia menetelmiä, lyhennettynä NGS: ksi, englanniksi "Seuraavan sukupolven sekvensointi ".

NGS: ään luetteloidut menetelmät edellyttävät aiempaa DNA-amplifikaatiovaihetta (ne eivät toimi yhdessä molekyylissä). Lisäksi käytetyt alustat vaihtelevat suuresti. Suosituimpien menetelmien periaatteet kuvataan seuraavassa:

pyrosekvensointi

Se käsittää pyrofosfaatin vapautumisen valvonnan, joka tapahtuu joka kerta, kun uusi nukleotidi lisätään DNA-juosteeseen. Entsyymisysteemi on kytketty siten, että valoemissio (joka on havaittavissa kameralla) tapahtuu joka kerta, kun uusi nukleotidi on sisällytetty.

Prosessi alkaa jokaisesta typpipohjan erillisestä inkuboinnista sen varmistamiseksi, onko valoaemissio. Pyrosekvensointi voi suorittaa pitkiä säikeitä, mutta havaittu virhetaso on korkea.

Sekvensointi synteesillä

Tähän liittyy leimattujen nukleotidien sisällyttäminen. Nämä fluoresoivat komponentit lisätään, pestään ja sisällytetty nukleotidi havaitaan. Sitten nukleotidimerkintä poistetaan, ja juosteen synteesi voi jatkua. Seuraavassa vaiheessa lisätään myös leimattu nukleotidi, ja mainitut vaiheet toistetaan.

Yksi tämän tekniikan haittapuoli ilmenee, kun fluoresoivia markkereita ei eliminoida kokonaan. Nämä päästöt aiheuttavat taustavirheitä, mikä aiheuttaa merkittäviä virheitä.

Sekvensointi ligaatiolla

Tämä tekniikka vaihtelee muista, koska se ei käytä DNA-polymeraasia. Sen sijaan tämän menetelmän avainentsyymi on ligaasi. Tässä käytetään fluoresoivasti leimattuja DNA-fragmentteja, joita entsyymi sitoo ja joka havaitaan.

Suurin ongelma tällä tekniikalla on sellaisen fragmentin hyvin lyhyt pituus, joka pystyy käsittelemään.

Ion-sekvenssin Torrent

Tämä tekniikka perustuu H-ionin mittaukseen+ joka vapautuu joka kerta, kun uusi nukleotidi on sisällytetty. Periaate on melko samanlainen kuin pyrosequencing, mutta paljon halvempi.

esimerkit

Ihmisen genomin sekvensointi

Ihmisten genomin sekvensointi on ollut biologian yksi lupaavimmista haasteista, ja se on myös yksi tunnetuimmista kilpailuista historian historiassa. Itse asiassa hankkeeseen osallistuneiden tutkijoiden osalta genomin sekvensointi tuli kilpailuksi.

Vuonna 1990 hän aloitti tunnetun tutkijan, Nobel-palkinnon voittaneen James Watsonin johtaman "ihmisen genomihankkeen". Vuoden kuluttua, vuonna 1991, Venter ottaa vastaan ​​haasteen Watsonin "lyönnistä" ja peräkkäisen genomin järjestämisestä hänen edessään. Vuonna 1992 Watson jäi eläkkeelle ja toinen tutkija otti komennon.

Vuonna 1995 Venter ilmoitti onnistuneensa bakteriaalisen genomin täydelliseen sekvensointiin satunnaisjärjestysmenetelmällä. Vastaavasti vastakkainen joukkue ilmoitti vuoden kuluttua hiivan genomin sekvensoinnin.

Vuonna 2000 kilpailu lopetettiin. Molemmat yhtiöt julkaisivat alustavat tulokset koko genomista kahdessa arvostetuimmista tieteellisistä lehdistä: luonto ja tiede.

Tiedemiehet kuitenkin jatkoivat ehdotusten parantamista, ja vuonna 2006 sekvenssit saatiin päätökseen tietyillä ihmisen kromosomeilla.

Tärkeys ja sovellukset

Tietäen yhtä tärkeän molekyylin nukleotidien järjestyksen kuin DNA on arvokas biologeille ja niihin liittyville ammattilaisille. Tämä polynukleotidiketju sisältää kaikki tiedot, jotka ovat välttämättömiä kaikkien elämänmuotojen kehittämiseksi ja ylläpitämiseksi.

Näistä syistä tämän sekvenssin tunteminen on välttämätöntä biologisen tutkimuksen kannalta. Periaatteessa sekvensointi antaa meille mahdollisuuden mitata yksi biologisten järjestelmien tärkeimmistä ominaisuuksista ja vahvistaa eroja niiden välillä.

Taksonomit ja systematistit käyttävät sekvensointia laajalti, koska tietyt DNA-sekvenssit mahdollistavat kriteerien määrittämisen siitä, kuuluvatko kaksi organismia samaan lajiin vai eivät, sekä kykenevät ehdottamaan hypoteeseja niiden välisestä filogeneettisestä suhteesta..

Lisäksi DNA-sekvensoinnilla on sovelluksia lääketieteen ja diagnostiikan alalla. Esimerkiksi on edullisia ja helposti saatavilla olevia järjestelmiä, joiden avulla sekvensoinnin avulla voidaan arvioida tiettyjen sairauksien (kuten syöpä) kehittymisen taipumusta käyttämällä niin sanottuja yksinkertaisia ​​nukleotidipolymorfismeja (SNP)..

Kriminalistisen ja rikosteknisen tyypin tutkimukset ovat myös rikastuneet sekvensointitekniikoilla, ja niitä voidaan käyttää luotettavina todisteina tietyn henkilön osallistumisesta rikokseen.

viittaukset

  1. Heather, J. M., & Chain, B. (2016). Sekvenssien sekvenssi: DNA: n sekvensoinnin historia. genomiikka, 107(1), 1-8.
  2. Koboldt, D.C., Steinberg, K. M., Larson, D.E., Wilson, R.K., & Mardis, E.R. (2013). Seuraavan sukupolven sekvenssin vallankumous ja sen vaikutus genomiikkaan. solu, 155(1), 27 - 38.
  3. Levy, J. (2010). Tieteelliset kilpailut. Galileosta ihmisen genomihankkeeseen. Paraninfo Toimituksellinen.
  4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNA-sekvensointi ketjun päättävillä inhibiittoreilla. Kansallisten tieteiden akatemiat, 74(12), 5463-5467.
  5. Schuster, S. C. (2007). Seuraavan sukupolven sekvensointi muuttaa nykypäivän biologiaa. Luontomenetelmät, 5(1), 16.
  6. Xu, J. (toim.). (2014). Seuraavan sukupolven sekvensointi. Caister Academic Press.