DNA-mikrolevyt siinä, mitä se koostuu, menettely ja sovellukset



DNA-mikrosiru, Sitä kutsutaan myös DNA-siruksi tai DNA-mikrosiruksi, se koostuu sarjasta DNA-fragmentteja, jotka on ankkuroitu muuttuvan materiaalin fyysiseen tukeen, joko muoviin tai lasiin. Kukin DNA-kappale edustaa sekvenssiä, joka on komplementaarinen spesifiselle geenille.

Mikrosirujen päätavoite on vertaileva tutkimus tiettyjen kiinnostavien geenien ilmentymisestä. Esimerkiksi on yleistä, että tätä tekniikkaa sovelletaan kahteen näytteeseen, joista toinen on terveissä olosuhteissa ja yksi patologinen, jotta voidaan tunnistaa, mitkä geenit ilmentyvät ja jotka eivät ole näytteessä, joka esittää tilannetta. Mainittu näyte voi olla solu tai kudos.

Yleensä geenien ilmentyminen voidaan havaita ja kvantifioida fluoresoivien molekyylien käytön ansiosta. Pelimerkkien manipulointi tapahtuu useimmissa tapauksissa robotilla ja suuri määrä geenejä voidaan analysoida samanaikaisesti.

Tämä innovatiivinen tekniikka on hyödyllinen monilla eri aloilla, lääketieteellisestä diagnostiikasta eri molekyylibiologian tutkimuksiin proteomiikan ja genomian aloilla..

indeksi

  • 1 Mitä se koostuu??
    • 1.1 Mikroharjan tyypit
  • 2 Menettely
    • 2.1 RNA-eristys
    • 2.2 cDNA: n tuotanto ja merkitseminen
    • 2.3 Hybridisaatio
    • 2.4 Järjestelmän lukeminen
  • 3 Sovellukset
    • 3.1 Syöpä
    • 3.2 Muut sairaudet
  • 4 Viitteet

Mitä se koostuu??

DNA-mikrosirut (deoksiribonukleiinihappo) ovat joukko spesifisiä DNA-segmenttejä, jotka on kiinnitetty kiinteään matriisiin. Nämä sekvenssit täydentävät geenejä, jotka haluavat tutkia, ja voi olla jopa 10 000 geeniä per cm2.

Nämä ominaisuudet mahdollistavat organismin geeniekspression systemaattisen ja massiivisen tutkimuksen.

Tiedot, joita solu tarvitsee sen toiminnalle, koodataan yksiköissä, joita kutsutaan "geeneiksi". Tietyt geenit sisältävät ohjeita olennaisia ​​biologisia molekyylejä, joita kutsutaan proteiineiksi.

Geeni ilmentyy, jos sen DNA transkriboidaan messenger-RNA: n välimolekyyliin ja geenin ilmentyminen voi vaihdella riippuen tämän DNA-segmentin transkription tasosta. Tietyissä tapauksissa ilmentymisen muutos voi olla osoitus sairauksista.

Hybridisaation periaate tekee mahdolliseksi mikrolevyjen toiminnan. DNA on molekyyli, joka koostuu neljästä nukleotidityypistä: adeniini, tymiini, guaniini ja sytosiini.

Kaksoiskierukkaisen rakenteen muodostamiseksi adeniini on ryhmitetty tymiinin ja sytosiinin kanssa guaniinin kanssa. Siten kaksi komplementaarista ketjua voidaan liittää vetysidoksilla.

Mikropiirien tyypit

Mikrosirujen rakenteen suhteen on olemassa kaksi muunnelmaa: komplementaarisen DNA: n tai oligonukleotidien henkilökohtaiset yhdisteet ja kaupallisten yritysten valmistamat kaupalliset korkean tiheyden mikropiirit, kuten Affymetrix GeneChip.

Ensimmäinen tyyppi microarray mahdollistaa analyysin RNA kahdesta eri näytteitä yhdellä sirulla, kun taas toinen muunnelma on kaupallinen tyyppi ja on suuri määrä geenejä (esimerkiksi Affymetrix GeneChip on noin 12000 ihmisen geenit), joka mahdollistaa analyysin yksi näyte.

prosessi

RNA-eristys

Ensimmäinen askel kokeilun suorittamiseksi käyttäen mikrorakennustekniikkaa on RNA-molekyylien eristäminen ja puhdistus (voi olla messenger-RNA tai muu RNA-tyyppi).

Jos haluat verrata kahta näytettä (terveitä ja sairaita, kontrollin ja hoidon välillä), molekyylin eristäminen molemmissa kudoksissa on tehtävä.

CDNA: n tuotanto ja merkitseminen

Tämän jälkeen RNA: lle suoritetaan käänteistranskriptioprosessi leimattujen nukleotidien läsnä ollessa ja näin saadaan komplementaarinen DNA tai cDNA..

Leima voi olla fluoresoiva ja sen täytyy olla erilaista kahden analysoitavan kudoksen välillä. Fluoresoivia yhdisteitä Cy3 ja Cy5 käytetään perinteisesti, koska ne emittoivat fluoresenssia eri aallonpituuksilla. Cy3: n tapauksessa väri on lähellä punaista ja Cy5 vastaa oranssin ja keltaisen välistä spektriä.

hybridisaatio

CDNA: t sekoitetaan ja inkubointi suoritetaan DNA-mikrosirussa, jotta molemmista näytteistä saadaan cDNA: n hybridisaatio (so. Sitoutuminen) DNA-osalla, joka on immobilisoitu mikrorakenteen kiinteälle pinnalle..

Suurempi prosenttiosuus hybridisaatiosta koettimen kanssa mikrorakenteessa tulkitaan vastaavan mRNA: n suurempana kudoksen ilmentymisenä.

Järjestelmän lukeminen

Ilmaisun kvantifiointi suoritetaan sisällyttämällä lukijajärjestelmä, joka määrittää värikoodin kunkin cDNA: n emittoiman fluoresenssin määrälle. Jos esimerkiksi punaista käytetään patologisen tilan merkitsemiseen ja se hybridisoituu suuremmassa suhteessa, punainen komponentti on vallitseva.

Tällä järjestelmällä on mahdollista tietää kummankin geenin yliekspressio tai repressio molemmissa valituissa olosuhteissa. Toisin sanoen, voit tietää kokeessa arvioitujen näytteiden transkriptoinnin.

sovellukset

Tällä hetkellä mikrorakeja pidetään erittäin tehokkaina välineinä lääketieteen alalla. Tämä uusi tekniikka mahdollistaa sairauksien diagnosoinnin ja paremman käsityksen siitä, miten geeniekspressiota muokataan erilaisissa sairaustilanteissa.

Lisäksi se mahdollistaa vertailukudoksen ja tietyllä lääkkeellä käsitellyn kudoksen vertailun mahdollisen lääketieteellisen hoidon vaikutusten tutkimiseksi.

Tätä varten normaalia tilaa ja sairasta tilaa verrataan ennen lääkkeen antamista ja sen jälkeen. Kun tutkitaan lääkkeen vaikutusta genomiin in vivo sinulla on parempi katsaus sen toimintamekanismiin. Lisäksi voidaan ymmärtää, miksi jotkut tietyt lääkkeet johtavat ei-toivottuihin sivuvaikutuksiin.

syöpä

Syöpä kärjistää DNA-mikrolevyillä tutkittujen sairauksien luettelot. Tätä metosologiaa on käytetty sairauden luokitteluun ja ennustamiseen erityisesti leukemian tapauksissa.

Tämän tilan tutkimisalaan kuuluu syöpäsolujen molekyylipohjien puristaminen ja karakterisointi, jotta löydettäisiin geeniekspressiota koskevat mallit, jotka johtavat epäonnistumiseen solusyklin säätelyssä ja solukuoleman (tai apoptoosin) prosesseissa..

Muut sairaudet

Mikrolevyjen avulla on pystytty selvittämään geenien erilaisen ilmentymisen profiileja allergioiden, primaaristen immuunipuutosten, autoimmuunisairauksien (kuten nivelreuman) ja tartuntatautien sairaudessa..

viittaukset

  1. Bednar, M. (2000). DNA microarray -tekniikka ja sovellus. Lääketieteen monitori, 6(4), MT796-MT800.
  2. Kurella, M., Hsiao, L., Yoshida, T., Randall, J. D., Chow, G., Sarang, S., ... & Gullans, S. R. (2001). Monimutkaisten biologisten prosessien DNA-mikrosiruanalyysi. Yhdysvaltain Nefrologian Seuran lehti, 12(5), 1072-1078.
  3. Nguyen, D. V., Bulak Arpat, A., Wang, N. & Carroll, R.J. (2002). DNA-mikrosirukokeet: biologiset ja teknologiset näkökohdat. Biometrics, 58(4), 701-717.
  4. Plous, C. V. (2007). DNA-mikrosirut ja niiden sovellukset biolääketieteellisessä tutkimuksessa. CENIC-lehti. Biologiset tieteet, 38(2), 132 - 135.
  5. Wiltgen, M., & Tilz, G. P. (2007). DNA-mikrosiruanalyysi: periaatteet ja kliininen vaikutus. hematologian, 12(4), 271-287.