Urea-liemen säätiö, valmistus ja käyttö

urea-liemi on nestemäinen kasvualusta, jota käytetään osoittamaan entsyymin ureaasin läsnäoloa tietyissä mikro-organismeissa. Ureasi on mikrobinen entsyymi, joka tuotetaan konstitutiivisesti eli se syntetisoidaan riippumatta siitä, onko substraatti, jolle se toimii, läsnä.

Ureaasin toiminta liittyy orgaanisten yhdisteiden hajoamiseen. Kaikki mikro-organismit eivät pysty syntetisoimaan tätä entsyymiä, joten sen määritys laboratoriossa sallii tiettyjen bakteerikantojen tunnistamisen ja jopa erottaa saman suvun lajit..

Urea-testiä on kahdenlaisia: Stuart ja Christensen. Ne eroavat niiden koostumuksesta ja herkkyydestä. Ensimmäinen on erityinen, jotta voidaan osoittaa suuri määrä ureaasia, joka on tuotettu Proteus-suvun lajeilla.

Toinen on herkempi ja voi havaita pieniä määriä ureaasia, joka on syntynyt muiden bakteerien sukujen, kuten Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter ja Mycobacterium, myöhään..

Stuart-urea-liemi koostuu ureasta, natriumkloridista, dikaliumfosfaatista, monokaliumfosfaatista, hiivauutteesta, fenolipunasta ja tislatusta vedestä..

Christensen-liemi tai agar-urea koostuu peptoneista, natriumkloridista, monokaliumfosfaatista, glukoosista, ureasta, fenolipunasta, tislatusta vedestä ja agar-agarista. Jälkimmäinen vain, jos se on kiinteä väliaine.

indeksi

• 1 Säätiö
  • 1.1 Stuart-urea-liemi
  • 1.2 Christensen-liemi tai agar-urea
  • 1.3 Molempien tiedotusvälineiden tulkinta (Stuart ja Christensen)
• 2 Valmistelu
  • 2.1 Stuart-urea-liemi
  • 2.2 Christensen-liemi tai agar-urea
• 3 Käyttö
• 4 Urea-testin kylväminen
• 5 Laadunvalvonta
• 6 Viitteet

perusta

Entsyymi ureaasi hydrolysoi urean muodostamaan hiilidioksidia, vettä ja kahta ammoniakkimolekyyliä. Nämä yhdisteet reagoivat muodostaen lopputuotteen, jota kutsutaan ammoniumkarbonaatiksi.

Stuart-urea-liemi

Stuart-urea-liemi on enemmän puskuroitu pH-arvolla 6,8. Siksi mikro-organismin on kyettävä muodostamaan suuria määriä ammoniumia punaiseksi fenoliksi. PH: n täytyy nousta yli 8.

Siksi Stuart-urea-liemi on selektiivinen Proteus-lajeille, mikä antaa positiivisia tuloksia 24–48 tunnin inkuboinnissa, eikä se ole tehokas bakteereille, jotka tuottavat vähän ureaasia tai jotka hidastavat hitaasti ureaa.

Tämä johtuu siitä, että Proteus-lajit voivat käyttää ureaa typpilähteenä. Sitä vastoin muut ureaasia tuottavat bakteerit tarvitsevat lisälähteen.

Pérez et ai. (2002) määritteli, että Stuart-urea-liemi oli yhtä tehokas kuin Christensenin ureaagar, ureaasin määrittämiseksi Candida-, Cryptococcus-, Rhodotorula-, Trichosporon- ja Saccharomyces-sukujen hiivakannoissa..

Tutkimuksen tekijät väittivät saavuttaneensa 100% sattuman molempiin väliaineisiin (Stuart ja Christensen) inkuboimalla 24 ja 48 tuntia; edellyttäen, että he ottivat niin positiivisia kantoja, jotka pystyivät kääntämään median vahvaksi vaaleanpunais-fuksia-väriksi.

Tämä selvennys on välttämätöntä, koska Lodder (1970) vahvisti, että lähes kaikki hiivat pystyvät sijoittamaan Christensenin urea-agarin viiston vaaleanpunaiseksi. Tämä johtuu siitä, että ne voivat hydrolysoida ureaa minimaalisina määrinä ja amiinien muodostumiseksi aminohappojen hapetuksella dekarboksyloimalla pinnalla. Tätä ei pitäisi tulkita positiiviseksi.

Christensenin liemi tai urea-agari

Christensen-urea-liemi tai agar on vähemmän puskuroitu, sillä se pystyy havaitsemaan pieniä määriä ammoniumia. Lisäksi tämä elatusaine on rikastettu peptoneilla ja glukoosilla. Nämä yhdisteet aiheuttavat muita ureaasia tuottavia mikro-organismeja, jotka eivät kasva Stuart-liemessä.

Samoin Christensen-urea-testi tarjoaa nopeampia tuloksia, erityisesti Proteusille, sillä se pystyy antamaan vahvan positiivisen vaikutuksen niin vähän kuin 30 minuutissa vähimmäisaikana ja enintään 6 tuntia maksimiaikana.

Loput ureaasia tuottavat mikro-organismit pystyvät kääntämään väliaineen värin hieman 6 tunnin kuluttua ja voimakkaasti 24, 48, 72 tunnin tai pidemmän jälkeen, ja jopa jotkut kannat voivat antaa heikkoja reaktioita 5 tai 6 päivän kuluttua.

Molempien tiedotusvälineiden tulkinta (Stuart ja Christensen)

Väliaine on alun perin kelta-oranssi, ja positiivinen reaktio muuttaa väliaineen värin vaaleanpunaiseksi. Värin intensiteetti on suoraan verrannollinen tuotetun ammoniumin määrään.

Negatiivinen reaktio jättää alkuperäisen värin väliaineen lukuun ottamatta hiivoja, jotka voivat antaa vaaleanpunaisen, Christensen-urea-agarilla..

valmistelu

Stuart-urea-liemi

Punnitaan tarvittavat grammit kaupallisen talon ohjeiden mukaan. Liuotetaan edullisesti steriiliin tislattuun veteen. Älä käytä lämpöä liukenemiseen, koska urea on herkkä kuumuudelle.

Kalvon suodatusmenetelmää käytetään sterilointiin. Tätä varten käytetään Millipore-suodatinta, jonka halkaisija on 0,45 μ. Älä käytä autoklaavia. Kun liuos on suodatettu, se jaetaan steriileihin putkiin. Luotettavien tulosten saamiseksi se on siirrettävä 1,5 ml: n vähimmäismääräksi 3 ml: aan maksimimäärästä putkea kohti..

Säilytä jääkaapissa ja liuosta ennen käyttöä.

Jos suodatusmenetelmä ei ole käytettävissä, väliaine tulisi käyttää välittömästi luotettavien tulosten saamiseksi.

Toinen tapa valmistaa urea-Stuart-liemi on seuraava:

Jotkut kaupalliset talot myyvät urea-analyysin puolet, mutta ei ureaa.

Kaupallisen talon ilmoittama määrä punnitaan. Se liuotetaan tislattuun veteen ja steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Anna sen levätä hieman ja kun väliaine on lämmin, lisätään 100 ml 20-prosenttisesti valmistettua urean liuosta ja steriloidaan suodattamalla.

Se jakautuu steriileihin putkiin, kuten aikaisemmin on kuvattu.

Christensenin liemi tai urea-agari

-Urean liuoksen valmistus

Punnitaan 29 grammaa dehydratoitua ureaa ja liuotetaan 100 ml: aan tislattua vettä. Käytä sterilointiin suodatusmenetelmää. Älä autoklaavi.

-Urea-emäksinen agar

24 g dehydratoitua emäsagaria liuotetaan 950 ml: aan tislattua vettä. Steriloidaan autoklaavissa 121 ° C: ssa 15 minuuttia. Anna seistä, kunnes se saavuttaa 50 ° C: n lämpötilan, ja lisää aiemmin valmistettu urea aseptisesti.

Kaada 4 - 5 ml steriileihin putkiin ja kallista, kunnes se on kiinteytynyt. Pitkän huiluhuipun pitäisi olla.

Tämä väliaine voidaan valmistaa myös nestemäisessä muodossa.

sovellukset

Urea-testi on erittäin tehokas erottamaan Proteus-suku muista Enterobacteriaceae-suvun sukuista, kun otetaan huomioon Proteuksen nopea reaktio.

Jos käytetään Christensenin koostumusta, testi auttaa erottamaan saman suvun lajit. Esimerkiksi, S. haemolyticus ja S. warneri späälle stafylokokki koagulaasi-negatiivinen ja betahemolyyttinen, mutta ne eroavat toisistaan S. haemolyticus se on negatiivinen urea ja S. warneri se on positiivinen urea.

Toisaalta McNulty käytti menestyksekkäästi 2% Christensen-urealientä tutkiakseen Helicobacter pylori näytteissä mahalaukun limakalvosta otetuista biopsioista (antral-alue).

Läsnäolo H. pylori se osoitetaan positiivisella ureatestillä. Tulosten tarkkailun kesto on suoraan verrannollinen läsnä olevien mikro-organismien määrään.

Kuten voidaan nähdä, se on yksinkertainen menetelmä diagnosoimiseksi Helicobacter pylori mahalaukun biopsioissa.

Lopuksi tämä testi on hyödyllinen myös erilaisten Brucella-, Bordetella-, Bacillus-, Micrococcus- ja Mycobacteria-lajien erottamiseksi..

Urea-testin kylväminen

Nämä kaksi menetelmää edellyttävät voimakasta mikrobi-inokulaattia tulosten optimoimiseksi. Bakteerikoloniat on edullisesti otettu veren agarista ja Sabouraud-agarhiivoista muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta. Inokulaatti emulgoidaan nestemäisessä väliaineessa.

Stuart-urea-liemessä, jota inkuboidaan 37 ° C: ssa 24 - 48 tuntia, tietäen, että etsitään vain Proteus-suvun kantoja, kun kanta on bakteeri. Hiivoja voidaan inkuboida 37 ° C: ssa tai huoneenlämpötilassa 24 - 48 tuntia inkubointia.

Christensen-urea-liemen tapauksessa inkuboidaan 37 ° C: ssa 24 tuntia. Jos testi on negatiivinen, sitä voidaan inkuboida enintään 6 päivää. Jos testi on positiivinen ennen 6 tuntia, se osoittaa, että se on Proteus-suvun kanta.

Christensen-urea-agarin tapauksessa agar-viiste on inokuloitu voimakkaasti ilman puhkaisua. Liemi inkuboidaan ja tulkitaan samalla tavalla.

Laadunvalvonta

Kontrollikantoja voidaan käyttää elatusaineen, kuten Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 ja Salmonella typhimurium.  Kaksi ensimmäistä on annettava positiivisia tuloksia ja kaksi viimeistä negatiivista tulosta.

viittaukset

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et ai. Stuart-urean liemen käyttö ureaasikokeessa hiivojen diagnosoinnissa. Soc. Ven. Microbiol. 2002; 22 (2): 136-140. Saatavilla osoitteessa: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biokemialliset testit kliinisesti merkittävien bakteerien tunnistamiseksi. 3. ed. Toimituksellinen Panamericana. Buenos Aires Argentiina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Bailey & Scottin mikrobiologinen diagnoosi. 12 toim. Toimituksellinen Panamericana S.A. Argentiina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinen diagnoosi. 5th ed. Toimituksellinen Panamericana S.A. Argentiina.
5. Laboratories Britania. Christensen Medio (Urea-agar-pohja) 2015. Saatavana osoitteessa: britanialab.com