Restriktioentsyymien toiminnot, toimintamekanismi, tyypit ja esimerkit



restriktioentsyymit ne ovat endonukleaaseja, joita tietyt arkistot ja bakteerit käyttävät estämään tai "rajoittamaan" virusten leviämistä niiden sisällä. Ne ovat erityisen yleisiä bakteereissa ja ovat osa niiden suojajärjestelmää vieraita DNA: ta vastaan, joka tunnetaan nimellä restriktio / modifiointijärjestelmä.

Nämä entsyymit katalysoivat kaksisäikeisen DNA: n leikkausta tietyissä kohdissa, toistettavasti ja ilman lisäenergiaa. Useimmat vaativat kofaktorien, kuten magnesiumin tai muiden kaksiarvoisten kationien, läsnäoloa, vaikka joissakin tapauksissa tarvitaan myös ATP- tai S-adenosyylimetioniinia.

Daniel Nathans, Arber Werner ja Hamilton Smith, jotka saivat Nobelin lääketieteellisen palkinnon, löysivät vuonna 1978 restriktioendonukleaaseja. Sen nimi johtuu yleensä organismista, jossa niitä havaitaan ensimmäistä kertaa.

Tällaisia ​​entsyymejä käytetään laajasti DNA-kloonausmenetelmien ja muiden molekyylibiologian ja geenitekniikan strategioiden kehittämisessä. Sen ominaisuuksien tunnistaminen tietyistä sekvensseistä ja kyky leikata sekvenssejä lähellä tunnistuskohtia tekevät niistä tehokkaita työkaluja geneettisessä kokeessa.

Tiettyyn DNA-molekyyliin vaikuttaneiden restriktioentsyymien tuottamia fragmentteja voidaan käyttää alkuperäisen molekyylin "kartan" uudelleenmuodostamiseen käyttämällä tietoja paikoista, joissa entsyymi katkaisi DNA: n.

Joillakin restriktioentsyymeillä voi olla sama tunnistuskohta DNA: ssa, mutta ne eivät välttämättä leikkaa sitä samalla tavalla. Täten on entsyymejä, jotka tekevät leikkauksia jättämällä tylpät päät ja entsyymit, jotka leikkaavat lähteviä kohesiivisia päät, joilla on erilaiset sovellukset molekyylibiologiassa.

Tällä hetkellä on olemassa erilaisia ​​kaupallisesti saatavilla olevia restriktioentsyymejä, joita tarjoavat eri kaupalliset talot; nämä entsyymit toimivat kuten "mukautetut" molekyylisakset eri tarkoituksiin.

indeksi

  • 1 Toiminnot
  • 2 Toimintatapa
  • 3 tyyppiä
    • 3.1 Tyypin I restriktioentsyymit
    • 3.2 Tyypin II restriktioentsyymit
    • 3.3 Tyypin III restriktioentsyymit
    • 3.4 Tyypin IV restriktioentsyymit
    • 3.5 Tyypin V restriktioentsyymit
  • 4 Esimerkkejä
  • 5 Viitteet

tehtävät

Restriktioentsyymit palvelevat polymeraasien vastakkaista funktiota, koska ne hydrolysoivat tai hajottavat esterisidoksen fosfodiestersidoksen sisällä vierekkäisten nukleotidien välillä nukleotidiketjussa.

Molekyylibiologiassa ja geenitekniikassa niitä käytetään laajasti työkaluina ekspressio- ja kloonausvektoreiden rakentamisessa sekä spesifisten sekvenssien tunnistamisessa. Ne ovat myös käyttökelpoisia rekombinanttien genomien rakentamisessa ja niillä on suuri bioteknologinen potentiaali.

Viimeaikaiset edistysaskeleet geeniterapiassa tekevät nykyisistä restriktioentsyymeistä tiettyjen geenien tuomiseksi vektoreihin, jotka ovat ajoneuvoja tällaisten geenien kuljettamiseksi eläviin soluihin, ja että luultavasti on kyky insertoida solun genomiin suorittamaan pysyviä muutoksia.

Toimintamekanismi

Restriktioentsyymit voivat katalysoida kaksisäikeisen DNA: n leikkausta, vaikka jotkut voivat tunnistaa yksijuosteisia DNA-sekvenssejä ja jopa RNA: ta. Leikkaus tapahtuu sekvenssien tunnistamisen jälkeen.

Vaikutusmekanismi on fosfodiesterisidoksen hydrolyysi fosfaattiryhmän ja deoksiribroosin välillä kunkin DNA-juosteen rungossa. Monet entsyymit kykenevät leikkaamaan samassa paikassa, jonka he tunnistavat, kun taas toiset leikkaavat 5–9 parin perusta ennen tai jälkeen..

Normaalisti nämä entsyymit leikataan fosfaatti- ryhmän 5'-päähän, jolloin saadaan DNA-fragmentteja 5'-fosforyylipäässä ja terminaalisen 3'-hydroksyylin päässä.

Koska proteiinit eivät pääse suoraan kosketukseen DNA: n tunnistuskohdan kanssa, ne on siirrettävä peräkkäin, kunnes ne saavuttavat tietyn kohdan, kenties DNA-juosteen "liukumekanismien" avulla..

Entsymaattisen leikkauksen aikana kunkin DNA-juosteen fosfodiesterisidos sijoitetaan restriktioentsyymien yhteen aktiiviseen kohtaan. Kun entsyymi lähtee tunnistus- ja leikkauspaikasta, se tapahtuu epäspesifisten transienttien yhdistysten kautta.

tyyppi

Tällä hetkellä tunnetaan viisi tyyppistä restriktioentsyymiä. Alla on lyhyt kuvaus kustakin:

Tyypin I restriktioentsyymit

Nämä entsyymit ovat suuria pentameerisiä proteiineja, joissa on kolme alayksikköä, rajoitus, metylaatio ja toinen DNA-sekvenssien tunnistamiseksi. Nämä endonukleaasit ovat multifunktionaalisia proteiineja, jotka kykenevät katalysoimaan restriktio- ja modifiointireaktioita, niillä on ATPaasiaktiivisuus ja myös DNA-topoisomeraasi.

Tämäntyyppiset entsyymit olivat ensimmäisiä endonukleaaseja, jotka löydettiin, ne puhdistettiin ensimmäistä kertaa 1960-luvulla ja siitä lähtien niitä on tutkittu syvällä syvyydellä.

Tyypin I entsyymejä ei käytetä laajalti bioteknologisena välineenä, koska leikkauspaikka voi olla vaihtelevalla etäisyydellä jopa 1000 emäsparia tunnistuskohdasta, mikä tekee niistä epäluotettavia kokeellisen toistettavuuden kannalta..

Tyypin II restriktioentsyymit

Ne ovat entsyymejä, jotka koostuvat homodimeereistä tai tetrameereistä, jotka leikkaavat DNA: ta määritellyissä kohdissa välillä 4 - 8 bp. Nämä leikkauspaikat ovat tyypillisesti palindromisia, eli ne tunnistavat sekvenssit, jotka luetaan samalla tavalla molempiin suuntiin.

Monet bakteerien tyypin II restriktioentsyymeistä leikkaavat DNA: ta tunnistettaessa vieraan luonteensa, koska niillä ei ole omaa DNA: n tyypillisiä muutoksia..

Nämä ovat yksinkertaisimmat restriktioentsyymit, koska ne eivät vaadi mitään muuta kofaktoria kuin magnesiumia (Mg +) tunnistamaan ja leikkaamaan DNA-sekvenssit.

Tyypin II restriktioentsyymien tarkkuus tunnistettaessa ja leikkaamalla yksinkertaisia ​​sekvenssejä DNA: ssa tarkoissa asemissa tekee niistä yhden käytetyimmistä ja välttämättömistä useimmissa molekyylibiologian aloilla.

Tyypin II restriktioentsyymien ryhmässä on useita alaluokkia, jotka on luokiteltu tiettyjen ominaisuuksien mukaan, jotka ovat ainutlaatuisia kullekin. Näiden entsyymien luokittelu tehdään lisäämällä aakkoset kirjaimilla A - Z entsyymin nimen mukaan.

Jotkut alaluokista, jotka tunnetaan parhaiten niiden hyödyllisyydestä, ovat:

Alaluokka IIA

Ne ovat eri alayksiköiden dimeerejä. Ne tunnistavat epäsymmetriset sekvenssit ja niitä käytetään ihanteellisina esiasteina leikkausentsyymien muodostamiseksi.

Alaluokka IIB

Ne koostuvat yhdestä dimeeristä ja leikkaavat DNA: n molemmilla puolilla tunnistussekvenssiä. Ne leikkaavat molemmat DNA-säikeet erilaisten emäsparien yli tunnistuspaikan ulkopuolella.

Alaluokka IIC

Tämäntyyppiset entsyymit ovat polypeptidejä, joilla on DNA-säikeiden jakautumisen ja modifioinnin tehtäviä. Nämä entsyymit leikkaavat molemmat säikeet epäsymmetrisesti.

Alaluokka IIE

Tämän alaluokan entsyymit ovat eniten käytetty geenitekniikassa. Niillä on katalyyttinen kohta ja ne tarvitsevat yleensä allosteerisen efektorin. Näiden entsyymien täytyy toimia vuorovaikutuksessa tunnistusjakson kahden kopion kanssa tehokkaan leikkauksen tekemiseksi. Tässä alaluokassa ovat entsyymit EcoRII ja EcoRI.

Tyypin III restriktioentsyymit

Tyypin III restriktioendonukleaasit koostuvat vain kahdesta alayksiköstä, joista yksi on vastuussa DNA: n tunnistamisesta ja muuntamisesta, kun taas toinen on vastuussa sekvenssin leikkaamisesta.

Nämä entsyymit edellyttävät kahta kofaktoria niiden toiminnalle: ATP ja magnesium. Tämäntyyppisillä restriktioentsyymeillä on kaksi epäsymmetristä tunnistuskohtaa, siirretään DNA ATP: stä riippuvaisella tavalla ja leikataan se 20 - 30 bp: n välein tunnistuskohdan viereen..

Tyypin IV restriktioentsyymit

Tyypin IV entsyymit on helppo tunnistaa, koska ne leikkaavat DNA: ta metylaatiotunnisteilla, ne koostuvat useista eri alayksiköistä, jotka vastaavat DNA-sekvenssin tunnistamisesta ja leikkaamisesta. Nämä entsyymit käyttävät kofaktorina GTP ja kaksiarvoista magnesiumia.

Erityisiä leikkauspaikkoja ovat nukleotidiketjut, joissa on metyloidun tai hydroksimetyloidun sytosiinin jäännöksiä yhdessä tai kummassakin nukleiinihappojohdossa.

Tyypin V restriktioentsyymit

Tämä luokittelu ryhmittelee CRISPER-Cas-tyypin entsyymit, jotka tunnistavat ja leikkaavat spesifisiä DNA-sekvenssejä hyökkäävistä organismeista. Cas-entsyymit käyttävät CRISPER-syntetisoidun ohjaavan RNA: n säikettä tunnistamaan ja hyökkäämään hyökkääviä organismeja.

V-tyypiksi luokitellut entsyymit ovat polypeptidejä, jotka on rakennettu tyypin I, II ja II entsyymien avulla. Ne voivat leikata lähes minkä tahansa organismin DNA: n osia ja suurella pituusalueella. Näiden entsyymien joustavuus ja helppokäyttöisyys tekevät näistä entsyymeistä nykyään tyypillisimpiä geenitekniikan työkaluja yhdessä tyypin II entsyymien kanssa..

esimerkit

DNA-polymorfismien havaitsemiseksi on käytetty restriktioentsyymejä, erityisesti populaatiogeneettisten tutkimusten ja mitokondrioiden DNA: ta käyttävien evolutionaaristen tutkimusten yhteydessä, jotta saadaan tietoa nukleotidisubstituutioiden nopeuksista..

Tällä hetkellä vektoreilla, joita käytetään bakteerien transformoimiseksi erilaisilla tarkoituksilla, on monikerroksisia kohtia, joissa havaitaan monien restriktioentsyymien tunnistuskohdat..

Näistä entsyymeistä suosituimmat ovat EcoRI, II, III, IV ja V, jotka on saatu ja kuvattu ensimmäistä kertaa E. coli; HindIII, alkaen H. influenzae ja BamHI: n B. amyloliquefaciens.

viittaukset

  1. Bickle, T. A., ja Kruger, D. H. (1993). DNA-restriktion biologia. Mikrobiologiset arviot, 57(2), 434-450.
  2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A. & Horvath, P. (2007). CRISPR tarjoaa hankitun resistenssin prokaryoottien viruksia vastaan. tiede, 315(Maaliskuu), 1709-1713.
  3. Goodsell, D. (2002). Molekulaarinen näkökulma: Restriktion endonukleaasit. Kantasolujen syyt syövän lääketieteessä, 20, 190-191.
  4. Halford, S. E. (2001). Hopping, hyppy ja silmukointi restriktioentsyymeillä. Biokemiallisen yhteiskunnan liiketoimet, 29, 363-373.
  5. Jeltsch, A. (2003). Lajin identiteetin ylläpito ja bakteerien spesifikaation hallinta: uusi funktio restriktio / modifiointijärjestelmille? geeni, 317, 13-16.
  6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewinin geenit XII (12 toim.). Burlington, Massachusetts: Jones & Bartlett Learning.
  7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Hän, Q. (2015). Tyypin I ja tyypin III CRISPR-Cas-järjestelmien käyttö genomin muokkaukseen. Nukleiinihappotutkimus, 1-12.
  8. Loenen, W. A.M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E.A. & Wilson, G.G. (2013). Tyypin I restriktioentsyymit ja niiden sukulaiset. Nukleiinihappotutkimus, 1-25.
  9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restriktio Endonukleaasit DNA-molekyylien analysoinnissa ja rakenneuudistuksessa. Annu. Biochem., 273-293.
  10.  Nei, M., ja Tajima, F. (1981). Dna-polymorfismi, joka on havaittavissa restriktioendonukleaaseilla. genetiikka, 145-163.
  11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V., & Wende, W. (2005). Cellular and Molecular Life Sciences Tyypin II restriktioendonukleaasit: rakenne ja mekanismi. CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, 62, 685-707.
  12.  Roberts, R. (2005). Miten restriktioentsyymeistä tuli molekyylibiologian työhevosia. PNAS, 102(17), 5905-5908.
  13.  Roberts, R. J. & Murray, K. (1976). Restriktion endonukleaasit. Kriittiset arviot biokemiassa, (Marraskuu), 123-164.
  14.  Stoddard, B. L. (2005). Tuleva endonukleaasirakenne ja toiminta. Biofysiikan neljännesvuosittaiset arviot, 1-47.
  15.  Tock, M. R., & Dryden, D. T. F. (2005). Rajoituksen ja rajoittamisen biologia. Nykyinen lausunto mikrobiologiassa, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
  16.  Wilson, G. G., ja Murray, N. E. (1991). Rajoitus- ja muokkausjärjestelmät. Annu. Genet., 25, 585-627.
  17.  Wu, Z. & Mou, K. (2016). Genominen näkemys Campylobacter jejunin virulenssista ja populaatiogenetiikasta. Tartuttaa. Dis. Muunto. med., 2(3), 109-119.
  18.  Yuan, R. (1981). Monitoimisten restriktio-endonukleaasien rakenne ja mekanismi. Annu. Biochem., 50, 285-315.